高效液相色谱法测定低聚壳聚糖含量

上海市兽药饲料检测所 商 军 王 蓓

低聚壳聚糖由甲壳质脱乙酰化的产物壳聚糖降解获得，从广义上来说，是相对分子质量约10000以下、水溶性好的低分子量壳聚糖；从狭义上而言，是指由2～10个以β-1，4键连接的N-乙酰葡糖胺基构成的甲壳寡糖或由2～10个葡糖胺基和/或N-乙酰葡糖胺基以β-1，4键连接构成的壳寡糖（郑建仙，2006；夏文水，2004）。

低聚壳聚糖具有提高动物免疫力，增强抗病能力；可代替抗生素、促生长剂，提高饲料效益；对家禽大肠杆菌、伤寒、下痢等病有较好的预防作用；能够改善肉质等，是一种应用前景广阔的新型饲料添加剂 （陈海燕等，2007；凌明亮等，2006；Tsai等，1999；Suzuki，1996）。 目前饲料工业中，低聚壳聚糖的质量控制和规范使用尚无国家标准和行业标准，而其质量控制的重要指标之一含量测定就非常重要，有关此类多糖含量测定主要为HPLC-示差折光测定法（Yasser，2002）或比色法对单糖定量（张伟杰，1994）。此类方法存在壳聚糖水解不完全、分析耗时、操作繁琐等问题，故难以推广使用。为此，本实验建立更为快速简便、适用性更强的高效液相色谱法直接测定低聚壳聚糖含量，经实验研究表明，结果令人满意。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Waters高效液相色谱系统（包括：Waters515泵、2487紫外检测器、柱温箱、717自动进样器、Empower色谱工作站）；超声波清洗器（SB2200 型），pH 计（ZD-1501，上海雷磁）；低聚壳聚糖标准品（纯度：93.4%，批号：LOT20073-0008，SIGMA-ALDRICH）；乙腈（色谱纯）；氢氧化钾（AR）；10 mol/L氢氧化钾溶液（取氢氧化钾66 g，加水使成 100 mL，充分搅匀，即得 10 mol/L）；磷酸（AR）；磷酸盐缓冲液（取1.0 mL的磷酸，加水使成2000 mL，充分搅匀；以10 mol/L氢氧化钾溶液调节至pH值，以pH计测定，为2.8～3.0，即得）；冰乙酸（AR）；水（电阻率＞ 10 MΩ·cm，符合GB/T6682一级用水的规定）；低聚壳聚糖原料（A厂 ， 批 号 ：0801121、0801206；B 厂 ， 批 号 ：T0800213）；畜禽复合预混合饲料（C厂，低聚壳聚糖含量：≥5%，0901023、0901024、0901025）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液制备

1.2.1.1 标准溶液制备 取低聚壳聚糖标准品约0.11 g（精确至 0.0002 g），置 100 mL棕色容量瓶中，加稀醋酸（1→6，V→V）3 mL，摇匀；加水适量，置超声波水浴中助溶30 min，冷却至室温，用水稀释至刻度，充分摇匀，滤过；准确量取该滤液10.00 mL，置50 mL棕色量瓶中，用流动相稀释至刻度，充分摇匀；经0.45 μm滤膜滤过，滤液作为标准溶液。

1.2.1.2 试样溶液制备 分别称取低聚壳聚糖原料约0.11 g和复合预混合饲料约2 g（约相当于低聚壳聚糖0.1 g），精确至0.0002 g，置100 mL棕色容量瓶中， 加稀醋酸 （1→6，V→V）3 mL，摇匀；加水适量，置超声波水浴中助溶30 min，冷却至室温，用水稀释至刻度，充分摇匀，滤过；精密量取该滤液10.00 mL，置50 mL棕色容量瓶中，用流动相稀释至刻度，充分摇匀；经0.45 μm滤膜滤过，滤液作为试样溶液。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：C18柱（长：150 mm，内径：4.6 mm，粒径：4 ～ 5 μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（pH：2.8 ～ 3.0）-乙腈（95+5，V+V）；流速：1.5 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：195 nm；进样量：20 μL。在上述色谱条件下，空白、低聚壳聚糖标准溶液（0.2 mg/mL）、低聚壳聚糖原料和预混料试样溶液（0.2 mg/mL）的典型色谱图见图1，保留时间约为1.6 min，分离度大于1.5。

图1 流动相中乙腈比例对保留时间和分离度的影响

1.2.3 试样测定 分别取标准品溶液和试样溶液，按“1.2.2”的色谱条件操作，分别注入液相色谱仪，得标准品和试样溶液中低聚壳聚糖的峰面积，按外标法计算试样中低聚壳聚糖含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件确定

2.1.1 检测波长 配制成一定浓度的低聚壳聚糖溶液 （0.2 mg/mL），用紫外分光光度仪在190～300 nm波长范围内进行扫描，结果显示低聚壳聚糖较为适宜的紫外检测波长为：195、205 nm及210 nm。分别选择195、205 nm及210 nm对同一浓度的低聚壳聚糖溶液进行测定，以峰面积进行计算，发现195 nm作为检测波长测定的峰面积较205 nm和210 nm处测定的要大，故选择195 nm作为检测波长。

2.1.2 流动相的优化 本研究采用乙腈与磷酸盐缓冲液为流动相，采用Agilent Eclipse XDB C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）， 流速为 1.5 mL/min，检测波长为195 nm，畜禽复合预混合饲料制备的试样溶液（0.2 mg/mL），进样量为 20 μL，比较了不同比例的乙腈和不同pH值的磷酸盐缓冲液对试样溶液中低聚壳聚糖色谱峰保留时间和分离度的影响。结果见图1、图2。试验结果表明，试样溶液中低聚壳聚糖色谱峰保留时间和分离度均随流动相中乙腈比例的增大而减小，当乙腈的比例大于10%时则导致保留时间过短，低聚壳聚糖无法与试样基质分离，从而影响试样的定量测定。比较而言，乙腈比例为5%时保留时间和分离效果均达到最佳。而磷酸盐缓冲液pH值在2.8～3.0时保留时间和分离效果均达到最佳。优化后低聚壳聚糖典型的色谱图见图3。

图2 磷酸盐缓冲液对保留时间和分离度的影响

2.1.3 流速 采用Agilent Eclipse C18柱（150 mm×4.6mm，5 μm），检测波长 195 nm，流动相为磷酸盐缓冲液（pH：2.8 ～ 3.0）-乙腈（95+5，V+V），低聚壳聚糖试样溶液 （0.2 mg/mL）进样量为20 μL， 以流速为 0.5、1.0、1.5 mL/min 和 2.0 mL/min分别进行测定，结果见图4。试验结果表明，流速为1.5 mL/min时，保留时间和分离效果均达到最佳。

图3 低聚壳聚糖的HPLC色谱图

图4 流速对保留时间和分离度的影响

2.2 线性关系 称低聚壳聚糖对照品适量（精确至0.0002 g），制成1.126 mg/mL的溶液作为标准贮备液， 分别精密量取 2.50、5.00、10.00、15.00、20.00 mL至50 mL棕色容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。取20 μL注入液相色谱仪，按“1.2.2”的色谱条件操作，记录色谱峰面积，以标准品溶液浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。试验结果表明，在0.056～0.450 mg/mL浓度范围内，线性关系良好。

2.3 精密度实验

2.3.1 重复性实验 分别取“2.2”的低聚壳聚糖标准品溶液（0.225 mg/mL）1 份，按“1.2.2”的色谱条件重复进样5次，检验实验方法的重复性；取0801121一批试样，按“1.2.1.2”的试样溶液制备，分别制备成试样溶液5份，按“1.2.2”的色谱条件进样，检验试样测定重复性，结果见表2。实验结果表明，低聚壳聚糖标准品峰面积的相对标准偏差 （RSD）为0.22%，保留时间的相对标准偏差（RSD）为0.94%；5份低聚壳聚糖试样峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.16%，系统和样品测定重复性均良好。

表1 低聚壳聚糖线性关系（n=3）

表2 方法的重复性实验结果

2.3.2 中间精密度实验 分取T0800213（以a标示）和0901023（以b标示）一批试样，分别于不同日期、不同人员和不同设备，按“1.2.1”的实验方法对该批试样的含量进行测定，结果见表3。实验结果表明，精密度均较好，T0800213含量测定结果的RSD为0.54%；0901023含量测定结果的RSD为1.53%。

表3 中间精密度实验结果%

2.4 稳定性实验 取 “2.3.1”的重复性实验中0801121 一批试样溶液， 分别于 0、2、4、6、8、10、24、30 h 和 36 h 进样 20 μL，在 0 ～ 10 h，测得峰面积的RSD为0.89%；在24 h后峰面积显著下降，说明试样有部分分解。实验结果表明，试样溶液在10 h内稳定。

2.5 回收率实验 分别称取已知含量的复合预混合饲料约1 g（精确至0.0002 g），共9份，分置于 100 mL 棕色量瓶中，加稀醋酸（1→6）3 mL，摇匀；加水适量，置超声波水浴中助溶30 min，冷却至室温，用水稀释至刻度，充分摇匀，滤过；分别精密量取上述滤液10.00 mL，分置50 mL棕色量瓶中，依高、中、低分别精密加入“2.2”线性关系中的标准贮备液 （1.126 mg/mL）12.00、10.00、8.00 mL置上述50 mL棕色量瓶，用流动相稀释至刻度，充分摇匀；经0.45 μm滤膜滤过，滤液作为试样溶液；另取低聚壳聚糖标准品，按“1.2.1.1”的标准品溶液制备操作，制备成标准品溶液。分别取20 μL注入液相色谱仪，按“1.2.2”的色谱条件操作，记录色谱图，按外标法计算测定结果，结果见表4。实验结果表明，试样不同含量的低聚壳聚糖平均回收率为96.7%，RSD为1.1%，方法的准确度较好。

表4 回收率实验测定结果

2.6 试样测定 分别称取低聚壳聚糖标准品及不同来源试样，按“1.2.1”的溶液制备，分别制备成标准品溶液和试样溶液，按“1.2.2”的色谱条件操作，分别注入液相色谱仪，得标准品和试样溶液中低聚壳聚糖的峰面积，按外标法分别计算试样中低聚壳聚糖含量。按上述方法本实验室（Ⅰ）与C厂实验室（Ⅱ）测定同批试样中的低聚壳聚糖含量，结果见表5。试验结果表明，两实验室测定原料和畜禽复合预混合饲料中低聚壳聚糖含量的结果无显著差异。

表5 试样测定结果（n=3）%

3 结论

以上实验结果表明，本法操作简便易行、快速，方法的准确性、重复性均较好，可用于低聚壳聚糖含量质量控制。

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