口腔鳞癌 Ezrin蛋白和 CD44v6表达及其与淋巴转移的相关性研究

陈 哲,柳宏志,刘继光

(1.佳木斯大学2007级硕士研究生,黑龙江佳木斯 154007;2.大庆油田总医院,黑龙江 大庆 163001;3.佳木斯大学口腔医院,黑龙江佳木斯 154002)

扩散和转移是影响恶性肿瘤患者生存时间和生存质量的主要因素之一,口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤,其发病率有增加趋势,细胞骨架蛋白 Ezrin作为连接膜和细胞骨架的蛋白,位于调节细胞行为多种途径的连接部位,影响细胞生存、运动、侵袭和黏附,与一些恶性肿瘤的发生、发展以及转移有关。 CD44v6蛋白是一种细胞黏附分子,具有黏附特性,能促进肿瘤细胞的浸润、生长,在肿瘤转移中起重要作用,本研究采用免疫组织化学染色技术检测了口腔鳞癌中Ezrin蛋白和 CD44v 6的表达,旨在探讨它们在口腔鳞癌的发生、发展及浸润转移中的作用及相互关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料

口腔鳞状细胞癌 32例。其中男19例,女 13例;年龄 40～81岁 ,平均 年龄 (60.5± 1.40)岁 ,其 中高分化 鳞癌 14例 ,中分化鳞癌 9例,低分化鳞癌 9例,TNM分期;T1+T2为 11例,T3+ T4为 21例。有颈淋巴结转移的17例 ,无颈淋巴转移的 15例。其中 1人 14月后发生肺转移。对照组 28例正常口腔黏膜来自良性肿瘤患者边缘手术标本。所有病例经 2位以上病理科医师确诊,临床资料来自住院及门诊病历。

1.2 试剂

鼠抗人 Ezrin蛋白免疫组化单克隆抗体、CD44V 6单克隆抗体、DAB显色剂 ,S-P超敏试剂盒(鼠 /兔),购自福建迈新生物技术开发公司。

1.3 实验方法

采用免疫组织化学抗生蛋白链菌素-生物素染色法。将4μ m厚的切片置于 55℃烘箱内烘烤3h以上。常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水。切片用体积分数3%双氧水溶液封闭内源性过氧化物酶,室温8min。用0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH值 6.0)于微波炉内 98℃抗原修复 8min,室温冷却。体积分数5%正常牛血清孵育15min(37℃),阻断非特异背景反应。分别加入一、二、三抗体,抗体孵育均在湿盒微波炉内 60～ 72℃孵育 5min,室温 5min。每一步骤后经 0.01mol/L磷酸盐缓冲液冲洗 3次,每次 5min。

一抗为 Ezrin单克隆抗体和 CD44v6单克隆抗体;二抗为生物素标记的羊抗鼠 /兔 IgG(linreagent);三抗为(链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶)streptavidin reagent。 DAB显色,Mayer′s苏木素复染,甘油明胶封片。每例取 1张切片 ,用磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定

Ezrin阳性着色在细胞膜及胞质内,呈棕黄色颗粒 ,均一弥漫性分布。CD44v6阳性着色在细胞膜,呈棕黄色。两者均按染色强度和阳性表达细胞数 ,参考Mathew等[1]分级标准:(-)无表达;(+)50%细胞阳性表达或浅染;(⧺)≥50%阳性表达且深染。

1.5 统计学分析

应用 SPSS13.0统计软件进行统计学分析,表达阳性率采用χ2检验,等级计数资料用秩和检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 口腔鳞状细胞癌和正常口腔鳞状上皮组织中 Ezrin和CD44-V6的表达

CD44v6蛋白定位细胞膜,为棕黄色颗粒,32例口腔鳞状上皮癌中 25例阳性表达,阳性率为 78.12%;28例正常口腔上皮中 9例为阳性表达,阳性表达率为 32.14%,两者表达差异显著,有统计学意义 (P＜0.05),Ezrin蛋白的阳性反应物质主要见于细胞质,少数可见于细胞膜,32例口腔鳞状上皮癌中21例阳性表达 ,阳性率为 65.62%;28例正常口腔上皮中 4例为阳性表达,阳性表达率为 14.28%,两者表达差异显著,有统计学意义 (P ＜ 0.05),见表1。

表1 CD44v6和 Ezrin在口腔鳞状细胞癌和正常鳞状上皮中表达的情况

2.2 口腔鳞状细胞癌中 Ezrin蛋白、CD44V6的表达与临床病理参数之间的关系

口腔鳞癌组织中 Ezrin蛋白的表达与患者的年龄、性别,临床分期无关 (P＞ 0.05),与肿瘤的分化分化程度、淋巴结转移有关 (P＜0.05)。CD44V6表达与患者的年龄、性别,临床分期无关 (P＞ 0.05),与肿瘤的分化分化程度(P ＜ 0.01)、淋巴结转移 (P ＜0.05)有关。 见表2。

表2 口腔鳞状细胞癌中 Ezrin蛋白、CD44V6的表达与临床病理参数之间的关系

2.3 Ezrin和 CD44-v6在口腔鳞癌组织中表达的相关性

Ezrin和 CD44-v6二者之间的相关系数是 0.572,二者的表达呈正相关 (P＜0.05),即 Ezrin表达越高,CD44-v6表达越高。见表3。

表3 CD44v6与Ezrin表达之间的关系

3 讨论

Ezrin蛋白为膜细胞骨架蛋白,属于 ERM家族成员之一,Ezrin蛋白主要定位于细胞膜内侧 ,通过其 C端和 N端氨基酸残基形成的结构域分别同细胞骨架肌动蛋白和包膜发生作用,在细胞的生长、运动、迁移和信号转移等一系列细胞功能方面发挥重要作用。研究表明,Ezrin蛋白通过调整粘附分子和信号转导等途径,参与细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用,从而在肿瘤发展、浸润和转移过程中发挥重要作用。研究表明 ,在许多肿瘤组织中均可见Ezrin蛋白的高表达,如骨肉瘤、视网膜恶性黑色素瘤、胰腺癌等。该试验结果表明 Ezrin蛋白在口腔鳞状细胞癌中高表达,表达率高于正常口腔上皮组织,这与 Ezrin在其他组织中的结果类似,提示 Ezrin蛋白对口腔鳞状细胞癌的发生和发展具有重要作用。在本实验的病例中显示 Ezrin的高表达和肿瘤的淋巴结转移密切相关,可见 Ezrin蛋白的表达可以用来预测肿瘤患者的预后,为早期判断预后以及临床治疗提供有利的依据。

3.1 CD44v6的表达与口腔鳞癌的关系

CD44v6是CD44的变异体,作为主要的细胞表面的跨膜糖蛋白,是肿瘤细胞获得侵袭转移能力的决定因素之一。从本研究可以看出 CD44v6在口腔鳞状细胞癌中的表达明显高于口腔正常上皮组织,两者差别有统计学意义,提示 CD44v6对口腔鳞癌发生具有重要的作用。 CD44v6与肿瘤的分化程度和淋巴结转移均密切相关,从本实验数据可以看出,分化程度越低的鳞癌组织中,CD44v6的表达水平越高,且具有统计学意义,在有淋巴结转移的鳞癌组织中,CD44v6的阳性率为 94.11%,在无淋巴结转移的鳞癌组织中其阳性率为60%,结果提示在有淋巴结转移的阳性率明显高于无淋巴结转移组 (P＜0.05)。但有部分学者[2]认为CD44v6不能作为独立口腔鳞癌的独立的预测因子应用于临床。

3.2 Ezrin蛋白和 CD44v6在口腔鳞癌中表达的相互关系

有学者研究表明,Ezrin蛋白可通过与 CD44v6的结合实现与细胞骨架的连接,而促进肿瘤的增生和转移,同时CD44v6的高表达可以使功能性 Ezrin蛋白的表达增加 ,使得肿瘤的转移和侵袭能力也随之增强[3]。在对神经系统肿瘤、大肠癌等研究中发现 Ezrin蛋白可直接或间接与 CD44v6蛋白等结合而调节瘤细胞的黏附性,影响肿瘤的侵袭性和转移[4,5]。本研究结果显示 ,在口腔鳞癌中的,Ezrin蛋白阳性表达率的增高,CD44v6阳性表达率也随之增高,并且两者有显著的相关性 (P ＜0.05)。并且 Ezrin蛋白与 CD44v6同为阳性表达的鳞癌组织的淋巴结转移率要明显高于 Ezrin蛋白与CD44v6同为阴性表达组,具有统计学意义 (P ＜0.05)。说明 Ezrin蛋白与 CD44v6具有且同作用,其高表达能够促进口腔鳞癌组织的侵袭和转移,对肿瘤预后的判断具有重要的意义。

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