纳洛酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织髓过氧化物酶的影响

李艳丽,程春凤

(佳木斯大学附属第二医院神经内科,黑龙江 佳木斯 154002)

缺血性脑血管病是神经科常见疾病,缺血脑组织在血供恢复后会发生再灌注损伤,再灌注损伤中炎性细胞与炎性介质可对微循环及脑组织造成严重损伤。近年研究纳洛酮在机体组织器官损伤、炎症及休克等情况下有一定保护作用。本研究通过观察纳洛酮在脑缺血再灌注后对脑组织中髓过氧化物酶的影响来探讨纳洛酮的神经保护作用,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 局灶性脑缺血动物模型

Wistar大鼠36只,体重320g左右,术前禁食过夜,自由饮水。大鼠随机分为6组,每组各6只大鼠。分别进行 MPO检测、红四氮唑染色及脑组织含水量测定等三种检测,每种检测分为纳洛酮治疗组及生理盐水对照组。大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型制作参照 koizumi线栓法。所有大鼠均栓塞右侧大脑中动脉,栓线采用头端涂聚乙烯醇的尼龙渔线。M CAO后2.5h,拔出栓线1cm长度,此时形成再灌注。供血从大脑前、后动脉流入大脑中动脉 ,再灌注前 5min,治疗组腹腔注药纳洛酮1.5mg/kg,对照组腹腔注射生理盐水1.5mL。术中及清醒前均给予头灯 (100w)照射,保持肛温37.0℃左右,室温24～ 25℃。再灌注2.5h后按实验的分组设计分别进行脑组织取材、染色及生化检测。

1.2 模型完成及评分标准

参照 Longa及 Bederon的5分制评分方法进行评分,0分:无神经系统损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向左侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。将0分、1分及4分大鼠去除,并补足各组设计所需大鼠数量。

1.3 MPO试剂盒操作过程

再灌注后迅速断头取脑,冰生理盐水快速漂洗,彻底去除标本表面血液后,于冰盘上在右侧半球(缺血侧)视交叉处为中心,向后冠状切取并精确称重150mg脑组织,做 M PO检测。MPO检测按照试剂盒说明书操作要求进行,并按试剂盒提供的公式进行计算。

1.4 红四氧唑染色及梗死体积测定

缺血再灌注后迅速断头取脑,将大脑半球放入冰箱冷冻至半硬状后取出,距额极1毫米处以1.0mm为厚度冠状切片。将切片放入 2%红四氮唑(2、3、5-氯化三苯基四氯唑,TTC)生理盐水溶液中避光37℃孵育0.5h,充分显色后切片照相,并用计算机图象分析系统进行切片梗死体积计算。

1.5 脑组织含水量测定

将待测大鼠右侧大脑半球取出后,在扭力天平上精确称湿重后置于 100℃烘箱内烘干 24h,再次称重。脑组织含水量按(湿重-干重)/湿重计算,以%表示。

1.6 实验药物及主要试剂

盐酸纳洛酮:北京四环医药公司产品,M PO试剂盒;南京建成生物工程公司产品。TTC:上海华东师范大学化工厂产品。

1.7 数据处理

2 结果

2.1 模型评分

制作成功的大鼠中 4只出现倾倒,评分3分,32只向左转圈 ,评分 2分。

2.2 各组 M PO含量检测、脑组织含水量、梗死体积及应用纳洛酮对其影响

见表1。

表1 两组脑组织 M PO含量、水含量及梗死体积检测 ±s,n=6)

表1 两组脑组织 M PO含量、水含量及梗死体积检测 ±s,n=6)

▲与对照组比较,P＜0.05;●与对照组比较,P＜0.05;■与对照组比较,P ＜0.05。

3 讨论

缺血的脑组织在恢复血供后会继续出现脑损伤,再灌注损伤是脑缺血损伤全过程中的一个重要部分。研究表明,脑缺血后白细胞浸润主要位于梗死区周边,再灌注后,则分布于整个缺血组织。白细胞浸润于缺血脑组织可阻塞微血管,损害血脑屏障,释放氧自由基和蛋白水解酶,直接损害神经细胞及诱导凋亡,使脑水肿及缺血加重。脑梗死患者缺血早期即有白细胞浸润,其严重程度与病灶大小及预后有关,并且这种白细胞浸润现象可持续到缺血后一个月。抑制白细胞浸润可增加脑血流量,改善脑功能,减轻脑损害及缩小梗死灶。脑缺血时浸润的白细胞成份主要是中性粒细胞,中性粒细胞的嗜苯胺兰颗粒中含有 M PO,其含量恒定,约占细胞干重的5%,该酶有使过氧化氢还原的能力,利用这一特点可测定该酶活力,因此,测定出 MPO的活力可以定量的反映出浸入组织内的白细胞数量。本研究中发现应用纳洛酮后缺血再灌注脑组织 MPO活性明显降低,与对照组比较有显著的统计学差异,说明缺血区脑组织浸润的中性粒细胞数量减少,这将有利于改善脑缺血区微循环供血情况,同时也将减少中性粒细胞释放生物活性物质造成的组织损伤。纳洛酮治疗组脑组织梗死体积及水肿均有明显减少,可能此种抑制白细胞在脑组织浸润的机制有关。研究证实脑缺血后缺血脑组织β-EP含量显著增加[1]。机体损伤情况下中性粒细胞 CD18、CD54表达与β-EP升高呈正相关。纳洛酮可以使休克大鼠中性粒细胞 CD18含量明显降低[2],可以使大鼠肠缺血再灌注致肺损伤大鼠 M PO含量下降[3]。这提示纳洛酮可以通过降低 β-EP水平而减轻炎性损伤 ,纳洛酮减少 M PO活性的作用可能为其能降低 β-EP(β-内啡肽)有关。另外在体外实验中发现纳洛酮能明显抑制中性粒细胞释放超氧自由基阴离子,并呈剂量效应关系。这说明纳洛酮还有可能直接作用于中性粒细胞,减少其释放损伤因子而达到神经保护作用。纳洛酮的作用机制较复杂,有可能减少缺血脑组织细胞凋亡[4,5],本实验中观察到纳洛酮降低了缺血脑组织 M PO活性,并减少了梗死体积,提示纳洛酮可能具有一定的神经保护作用,但纳洛酮对缺血脑组织更进一步的作用机理还不十分清楚,值得进一步研究。

[1] 常高峰,刘兴才,张基漠 .脑缺血再灌注时脑组织内啡肽的实验研究-纳洛酮治疗迟发神经元损伤疗效观察 [J].中风与神经疾病杂志,1993,10(3):132-135

[2] 梅冰,庚舟,杨瑞和.创伤性休克大鼠中性粒细胞 CD18、糖皮质激素受体的变化及纳洛酮治疗作用的研究 [J].上海医学,2000,23(1):19-22

[3] 何中乾,蒋健,陆一鸣.纳洛酮在大鼠肠缺血再灌注致肺损伤中保护作用的初步研究 [J].中国急救医学,2001,21(2):69-71

[4] 王雪红,赵嘉训.纳洛酮对脑缺血 /再灌注损伤保护机制的研究进展 [J].国际麻醉学与复苏杂志,2008,29(5):20-21

[5] 徐丽瑾,毕长柏,于哩哩.纳洛酮对大鼠全脑缺血-再灌注损伤后神经细胞凋亡的影响 [J].脑与神经疾病杂志,2008,16(5):35-36