嗅三针对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马ET和CGRP含量的影响

杨晓航 ，刘智斌 *，牛文民 ，王 渊

（1.陕西中医学院医学技术系，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医学院针灸推拿系，陕西 咸阳 712046）

血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是由脑血管疾病因素导致脑组织损害而引起的痴呆综合征，是唯一可以有效预防和治疗的老年期痴呆病。众多研究资料表明，脑组织血管舒缩因素平衡失调是VD的重要病理机制[1]。笔者依据多年来治疗VD的经验[2-3]，选择VD大鼠作为实验对象，研究嗅三针（两侧“迎香”及“印堂”穴）对VD大鼠学习记忆能力及海马内皮素（endothelin，ET）和降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）含量的影响。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 成年Sprague Dawley雄性大鼠40只，体质量（300±10）g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供（动物编号：0001450）。

1.1.2 仪器 SDQ-30双极射频电凝器（上海手术器械厂出品）；Morris水迷宫实验系统 （北京现代太极电子有限公司出品）；SN-695B型放射免疫测量仪 （上海核仪器一厂出品）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 VD大鼠动物模型 按照经典的四血管阻断（4-Vesselocclusion,4-VO）方法制作血管性痴呆模型[4]。用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g体质量）腹腔注射麻醉大鼠，常规无菌操作。颈部背侧后正中切口，暴露第一颈椎横突孔，电凝烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞。24 h后，颈部腹侧前正中切口，分离双侧颈总动脉，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5 min,共夹闭3次，每次间隔1 h。手术部位施以适量青霉素抗感染，仔细缝合，常规饲养。VD嗅球损毁大鼠动物模型 参照陈志蓉报道的损毁大鼠嗅球的方法[5]，将VD造模成功的大鼠用水合氯醛麻醉后，固定在立体定位仪上。在大鼠颅顶正中切开皮肤，小范围分离暴露前囟。在大鼠颅顶正中线位于前囟前面5 mm两侧旁开2 mm处，分别钻2个直径为1 mm的小孔。将HS-80型电烙铁的烙头插入颅内，电凝损毁双侧嗅球。

1.2.2 动物分组 随机分为4组，即正常组、VD模型组（大鼠造VD动物模型）、VD嗅球损毁模型组 （大鼠造VD动物模型及嗅球损毁并行嗅三针治疗）、嗅三针组（大鼠造VD动物模型并行嗅三针治疗），每组10只。

1.2.3 嗅三针的定位与操作 嗅三针穴定位为两侧迎香及印堂穴。依据李忠仁教授主编的《实验针灸学》动物选穴标准[6]，“迎香”穴：大鼠鼻孔外侧上端，有毛与无毛交界处；“印堂”穴：大鼠两眼眶上缘中点连线与正中线交点。操作：选用“华佗牌”不锈钢针，30号0.5寸毫针。迎香穴向内上方斜刺0.3 cm，印堂穴向鼻根部平刺0.3 cm。G6805电针仪，上海医疗仪器厂出品；刺激参数：疏密波，刺激强度以保持针刺局部轻微抖动为度 （电流强度：1～3 mA，电压：1～3 V）。 留针 10 min，持续电刺激，每日 1次。5 d为1个疗程，休息2 d，共进行6个疗程。从VD模型组和VD嗅球损毁模型组造模完成当日起，正常组和VD模型组每日1次采取与嗅三针治疗相同的捉拿固定，但不实施针刺干预，正常饮食饲养42 d；VD嗅球损毁模型组及嗅三针组均采用嗅三针治疗42 d。

1.2.4 Morris水迷宫定位航行试验[7]治疗结束后第1天，开始水迷宫测试。水迷宫内水深41 cm，水温22～26℃。在水池壁标明4个入水点，由此将水池等分为4个象限，任选一象限正中放置平台，没于水下1 cm，水面覆盖塑料泡沫。将受试大鼠按顺时针方向依次由E、S、W、N 4个入水点顺序面向池壁放入水中。记录2 min内寻找平台的时间（逃避潜伏期）。如果大鼠在2 min内找到平台，记录其实际逃避潜伏期及游泳路程；如果大鼠在2 min内未找到平台，由测试者将其引上平台并停留10 s,逃避潜伏期记录为2 min。历时3 d,每日1次。用3 d找到平台的平均逃避潜伏期和平均游泳路程评价动物的学习记忆能力。

1.2.5 海马ET和CGRP含量测定 水迷宫实验3 d结束后，各组大鼠断头后快速取出全脑，在冰盒上分离海马。用冷生理盐水冲洗，滤纸吸干附着的液体后，称质量后加入0.1 mol/L HAC 2mL，100℃水浴中煮沸10 min。充分匀浆后倒入塑料指形管中，4℃离心 （3 000 r/min，20 min），取上清液置于-20℃冰箱内保存待检测。海马ET和CGRP含量测定采用放射免疫法，试剂盒购自南京建成生物工程研究院，按照药盒说明书操作。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.0软件对数据进行处理。实验数据均用“±s”表示，采用单因素方差分析、组间均值进行t检验。

2 结果

2.1 嗅三针对大鼠Morris水迷宫定位航行的影响

各组大鼠嗅三针治疗后，与正常对照组比较，VD模型组3 d平均逃避潜伏期和平均游泳路程均延长，差异有统计学意义（P<0.01）；与VD模型组比较，嗅三针组3 d平均逃避潜伏期和平均游泳路程均缩短，差异有统计学意义（P<0.01）；与VD模型组比较，嗅三针对VD嗅球损毁模型3 d平均逃避潜伏期和平均游泳路程无影响，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 嗅三针对大鼠Morris水迷宫定位航行的影响 （n=10，±s）

表1 嗅三针对大鼠Morris水迷宫定位航行的影响 （n=10，±s）

注：与正常对照组比较▲P<0.01；与VD模型组比较*P>0.05，**P<0.01；与VD嗅球损毁模型组比较△P<0.01。下同。

组 别正常对照组VD模型组VD嗅球损毁模型组嗅三针组平均逃避潜伏期（s）平均游泳路程（cm）14.56±7.15 102.56±17.12 112.68±14.53▲ 155.68±16.53▲121.18±15.12* 163.15±15.11*64.16±12.18**△ 114.16±12.28**△

2.2 嗅三针对大鼠海马ET和CGRP含量的影响

与正常对照组比较，VD模型组海马ET含量增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与VD模型组及VD嗅球损毁模型组比较，嗅三针组海马ET含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与正常对照组比较，VD模型组海马CGRP含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与VD模型组及VD嗅球损毁模型组比较，嗅三针组海马CGRP含量增高，差异有统计学意义（P<0.05）；VD模型组与VD嗅球损毁模型组比较，嗅三针对海马ET、CGRP含量均无影响，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。

3 讨论

血管性痴呆（Vascular Dementia,VD）属于中医学“善忘”、“呆病”、“痴证”等范畴。依据现代医学理论，VD是由于心脑血管病变，因缺血性或出血性脑组织损害所导致的认知功能障碍，是老年痴呆的常见类型。研究结果表明，脑组织血管舒缩因素平衡失调是VD的重要病理机制[1]。

表2 嗅三针对大鼠海马ET和CGRP含量的影响 （n=10，±s）

表2 嗅三针对大鼠海马ET和CGRP含量的影响 （n=10，±s）

组 别正常对照组VD模型组VD嗅球损毁模型组嗅三针组ET（pg/mg）CGRP（pg/mg）18.72±4.72 785.36±46.96 32.11±5.78▲ 668.48±41.33▲35.15±4.56* 683.85±42.16*24.36±2.62**△ 732.12±47.12**△

ET和CGRP是机体内最强的缩血管和舒血管多肽，对脑组织血液循环发挥重要的调节作用。相关研究表明，VD患者的脑组织中ET含量增高、同时CGRP含量降低。ET可引发过氧化反应、促进兴奋性氨基酸释放，从而加剧脑组织缺血性损害。相反地，CGRP却具有增加脑血流量和神经保护的双重作用[8-9]。本研究结果显示，嗅三针能够明显增强VD模型大鼠学习记忆能力，并且能降低VD模型大鼠海马ET含量同时提高CGRP含量。然而，对于VD损毁嗅球模型大鼠，嗅三针未能增强其学习记忆能力也没有明显影响海马ET和CGRP的含量。这表明嗅三针对于VD大鼠的疗效是通过嗅觉传导路对中枢神经系统产生作用的，这与笔者前期的研究结果相一致[2]。

本研究证实了嗅三针对VD的治疗作用是确切的，其作用机制与调节海马ET和CGRP含量密切相关，其疗效的发挥有赖于嗅觉传导路的完整性。

[1]胡 蓉，严 洁，李铁浪.电针不同穴位对脑缺血大鼠血浆和脑组织内皮素、降钙素基因相关肽含量的影响[J].针刺研究，2008，33（3）：169-172.

[2]刘智斌，牛文民，杨晓航，等.嗅三针治疗血管性痴呆的随机对照研究[J].针刺研究，2008，33（2）：131-134.

[3]刘智斌，牛文民，杨晓航，等.头部发际区排针法治疗血管性痴呆疗效观察[J].中国针灸，2007，27（6）：412-414

[4]赖新生，王 黎，江雪华.电针对实验性血管性痴呆大鼠学习记忆及 SOD 和 MDA 的影响[J].中国针灸，2000，20（8）：497-500.

[5]陈志蓉.贯叶连翘提取物对大鼠双侧嗅球损毁模型的行为学影响[J].中国药学杂志，2004，39（9）：663-666.

[6]李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2004：327-329.

[7]Morris R G.Place navigation impared in rats with hippocampal lessens[J].Nature,1982，297（5 868）：681-682.

[8]Yanagisawa M,Kuceihara H,Kinura S1A novel potent vasoconstrictor peptide by vascular endothelial cells[J].Nature,1988，332（6 163）：411-415.

[9]花 放，方秀斌，张 璐.降钙素基因相关肽对大鼠全脑缺血再灌注脑组织的保护作用[J].卒中与神经疾病，2002，9（6）：331-334.