电针足阳明经（穴）促大鼠胃黏膜损伤修复过程中P-RAF-1表达的影响

陈楚淘，田浩梅，严 洁，张英进，姚 雯，易受乡*

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410007；湖南中医药大学针灸推拿学院经穴脏腑相关重点研究室，湖南 长沙 410007）

本课题组前期研究通过蛋白芯片技术从720种已知蛋白中快速筛选磷酸化水平发生改变的蛋白，综合分析发现以丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路上的蛋白磷酸化的水平改变最为明显，其中以RAF-1蛋白的表达上调量最明显，故进一步选用分子生物方法加以分析，确定与胃黏膜修复有关的信号蛋白种类，阐明电针足阳明胃经促胃黏膜修复的部分作用机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取 SD大鼠，雄性，体质量（200±20）g，共40只，由上海必凯尔实验动物中心提供,许可证号sdxk(沪)2003-0002，饲养于湖南中医药大学实验动物中心，实验前适应环境1周，控制室温20～22℃，相对湿度65%～70%。动物实验于湖南中医药大学实验动物中心和国家中医药管理局三级实验室、经穴与脏腑相关重点研究室完成。

1.1.2 仪器 酶标仪 （Thermo）；电泳仪 （北京六一仪器厂）；电泳、转移装置（BIO-RAD）；磁力搅拌器（太仓华美生化仪器厂）；脱色摇床（兴化化仪器厂）；反应容器（上海康成生物有限公司）；G6805-2型电针仪。

1.1.3 试剂 磷酸化RAF-1抗体（CST公司）；细胞及组织总蛋白抽提试剂盒 （KangChen，KC-415）；BCA蛋白质定量试剂盒（KangChen，KC-430）；丙烯酰胺、双丙烯酰胺、20%SDS（w/v）、Tris-Cl 1.0 M pH 8.8、Tris-Cl 1.0 M pH 6.8、10%APS、TEMED、生物素的标记的蛋白分子量标准（KangChen，KC-410）、 甘氨酸、β 巯基乙醇溴酚蓝、10×电泳缓冲液（Tris碱 30.3 g，甘油 144 g，SDS 10 g，双蒸水调至体积为1 L）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 动物编号并随机分为4组，每组10只。A组：空白组；B组：模型组；C组：针刺治疗组；D组：针刺对照组。

1.2.2 动物造模 参照无水乙醇灌胃法[1]制作大鼠胃黏膜损伤模型，除空白组外，其余造模大鼠均禁食不禁水24 h，24 h后行无水乙醇灌胃，先用普通注射针头，按灌胃乙醇剂量为0.8 mL/100 g吸取相应剂量，再接上普通大鼠灌胃针头，按一般的灌胃方法将无水乙醇灌胃1次，同时恢复普通饮食,根据预试实验结果，24 h后造模大鼠胃黏膜可充血水肿，出现点状或线状的出血点，提示造模成功。

1.2.3 穴位定位 参考林文注主编[2]《实验针灸学》常用动物穴位定位法及拟人对照法定位。足三里：膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处；梁门：腹正中线与锁骨中线之间的中线上，脐[3]（根据类比原理，在大鼠胸腹正中线，胸骨柄上缘至外生殖器连线的上3/4与下1/4交界处）上4寸；四白：眶下缘正中；非穴对照点：与足三里穴、梁门、四白穴内侧旁开约0.3 cm的非经非穴点。

1.2.4 针刺方法 取大鼠双侧足三里、梁门穴、四白穴或非穴对照点，1次/d，连续7 d。大鼠仰卧位束缚于鼠板上，针刺相应的穴位和对照点后，固定针刺深度，接上G6805-2型电针仪，电针波形为疏密波，疏波4HZ，密波50HZ，脉冲宽度0.5 ms，输出电压2～4 V，强度以大鼠的肢体轻颤为度，电针时间30 min，连续7 d。实验动物常规饲养1周后，随机挑选10只为空白组，其余30只大鼠成模后再将大鼠随机分为3组：模型组、针刺治疗组与针刺对照组。

空白组及模型组：每日纯束缚于鼠板上30 min，不做其它处理，每日实验1次，共7 d。针刺治疗组：大鼠仰卧位束缚于鼠板上，针刺双侧足三里、梁门、四白穴，然后于足三里穴和梁门穴接上电针，共两对电针，同侧足三里穴和梁门穴与同一对电针相连，正极接足三里穴，负极接梁门穴，电针时间30 min，电针参数参考针刺方法，连续7 d。针刺对照组：大鼠仰卧位束缚于鼠板上，针刺双侧足三里、梁门、四白穴的内侧约0.3 cm的非经非穴点处，然后于足三里穴和梁门穴的对照点接上电针，共两对电针，同侧足三里穴和梁门穴的对照点与同一对电针相连，正极接足三里穴对照点，负极接梁门穴对照点，电针时间30 min，电针参数参考针刺方法，连续7 d。

1.2.6 胃黏膜标本制备 7 d所有大鼠处理后取材，迅速切开大鼠腹部，取出整胃，用4℃的生理盐水冲洗胃的表面，随机每份挑选5只将胃沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗干净，行胃黏膜损伤指数计数，剩余5只将胃反转，行胃黏膜损伤指数计数，参照本课题组前期的报道[4]，采用链霉蛋白酶消化法提取胃黏膜细胞，行免疫印迹检测。

1.2.7 胃黏膜损伤指数计数 参照GUTH法检测溃疡指数。全胃各病灶长度之和为损伤指数，以mm表示。损伤≤1 mm（包括糜烂点）为1分；1 mm＜损伤≤2 mm为2分；2 mm＜损伤≤3 mm为3分；3 mm＜损伤≤4 mm为4分；＞4 mm为5分；损伤宽度＞2 mm者UI加倍。

1.2.8 P-RAF-1检测方法 取胃黏膜细胞提取总蛋白，制备SDS-PAGE凝胶，加样电泳,采用半干法转膜。将PVDF膜分别浸入含10%脱脂奶粉TBST的封闭液 (室温封闭l h)、TBS配制一抗稀释液，4℃过夜、HRP标记的二抗稀释液，室温2 h。最后将膜置于X光片盒中，曝光2～4 min，显影40 s，定影2 min，水洗5 min。 每一步骤注意充分水洗，避免非特异性染色。图片扫描保存为电脑文件，并用Image J分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化计算出相对值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 电针足阳明经(穴)对大鼠胃黏膜损伤指数的影响

（1）与空白组比较，模型组胃黏膜损伤指数值明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示造模成功；（2）针刺治疗组胃黏膜损伤指数值显著低于模型组和针刺对照组(P<0.01)，提示电针足三里、梁门、四白穴可减轻无水乙醇灌胃造成的胃黏膜损伤，对胃黏膜具有修复作用，且存在穴位特异性。结果见表1。

表1 对大鼠胃黏膜损伤指数比较 （±s）

表1 对大鼠胃黏膜损伤指数比较 （±s）

注：与空白组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.01；与针刺对照组比较▼P<0.01。

组 别空白组模型组针刺对照组针刺治疗组n 10 10 10 10 UI 5.60±2.84 14.40±5.58*13.20±3.79*7.00±2.94△▼

2.2 电针足阳明经(穴)对大鼠胃黏膜PCNA的影响

（1）与空白组比较，模型组胃黏膜PCNA-LI明显降低，差异具有统计学(P<0.05)；（2）与模型组比较，针刺治疗组与针刺对照组的胃黏膜PCNA-LI明显增高，差异具有统计学意义 (P<0.01和P<0.05)；（3）与针刺对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，但针刺治疗组PCNA-LI高于针刺对照组，结果提示应激造模后，胃黏膜增殖能力下降，电针“四白”、“梁门”、“足三里”穴可促进胃黏膜损伤后的细胞增殖修复，且针刺治疗组效果优于针刺对照组。结果见表2。

表2 电针足阳明经（穴）对胃黏膜受损大鼠胃黏膜PCNA-LI的影响 （±s，个/μm2）

表2 电针足阳明经（穴）对胃黏膜受损大鼠胃黏膜PCNA-LI的影响 （±s，个/μm2）

注：与空白组比较*P<0.05；与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01。

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3.3 电针足阳明胃经（穴）对大鼠胃黏膜细胞RAF-1磷酸化水平的影响

因模型组与针刺对照组各有一例样本蛋白量不够而被剔除。（1）与空白组比，模型组的RAF-1磷酸化水平检测值显著降低 （P<0.05），说明大鼠的胃黏膜受损抑制了RAF-1磷酸化；（2）与空白组比，针刺治疗组RAF-1磷酸化水平检测值显著提高，差异具有统计学意义（P<0.01），而针刺对照组无统计学意义（P>0.05），表明了穴位的特异性；（3）与模型组比较，针刺治疗组RAF-1磷酸化水平检测值升高，差异具有统计学意义（P<0.01），针刺对照组差异有统计学意义（P<0.05），提示电针后两组的RAF-1磷酸化水平均得到了提高；（4）针刺治疗组与针刺对照组比较，差异有统计学意义 （P<0.05），提示针刺对照组诱发RAF-1磷酸化的作用不及针刺治疗组，表明针刺 “足三里”“四白”、“梁门”穴在促胃黏膜修复的过程中与RAF-1蛋白磷酸化有关。结果见表3、图1。

表3 电针足阳明胃经（穴）对大鼠胃黏膜细胞RAF-1磷酸化水平的影响 （±s）

表3 电针足阳明胃经（穴）对大鼠胃黏膜细胞RAF-1磷酸化水平的影响 （±s）

注：与空白组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01；与针刺对照组比较▼P<0.05。

组 别空白组模型组针刺对照组针刺治疗组n5445 P-RAF-1 相对密度值（p-RAF-1/β-actin）0.934±0.045 0.814±0.119*0.971±0.079△1.119±0.053**△△▼

3 讨论

蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程，尤其在细胞应答外界刺激的信号传递途径中，蛋白质磷酸化是目前所知道的最主要方式[5-6]，Raf家族是都具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的信号转导蛋白质[7-9]，Raf-1能否被磷酸化，能否被激活、是否能够准确地下传信号对于细胞是否出现增效应至关重要[9]。

raf是一种原癌基因，其家族中包括A-raf，B-raf和C-raf-1 （c-raf，raf-1），Raf家族是都具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的信号转导蛋白质[7-8]。C-Raf-1是由648个氨基酸组成，位于3号染色体3P25，是分子量为74 KDa的细胞质丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,活化后具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性。raf-1在生理的情况下可以激活MEK1和MEK2，MEK1/MEK2激活后，可以磷酸化一系列的胞浆蛋白[8]。此通路的活化主要引起细胞的有丝分裂及活化。Raf-1能否被激活、是否能够准确地下传信号对于细胞是否出现增效应至关重要[9]。raf-1与ERK1/2实际上为MAPK信号转导通路中c-Raf-MEK-ERK信号转导通路的重要组成部分[10-14]。c-Raf-MEK-ERK信号转导通路是诸多信号途径中与细胞增殖、分化密切相关的最重要信号通路之一。通过特定的丝/苏氨酸残基的磷酸化c-Raf.MEK.ERK1/2蛋白可被依次活化，参与调控细胞的生长、增殖、分化和凋亡等多种生理功能。

胃黏膜细胞增殖能力是影响溃疡愈合的重要因素，PCNA在细胞增殖和DNA合成过程中也起重要作用，是目前较常用的评价细胞增殖的指标。唐志鹏等[1]在对实验性胃溃疡大鼠进行的研究中发现，再生黏膜的腺体底部细胞增殖增多，溃疡边缘黏膜的细胞增殖带位置上移，而且PCNA标记的增殖指数增加。Kitajima等[15]运用免疫组织化学染色检测PCNA以反映乙酸诱发大鼠胃溃疡的细胞增殖动力学，发现在建立溃疡后PCNA标记指数增加，溃疡边缘黏膜细胞增殖活性增强,易受乡等[16]发现预先艾灸足三里、梁门穴可显著增加胃黏膜增殖指数促胃黏膜修复。

本实验结果提示，大鼠无水乙醇灌胃形成胃黏膜损伤以后，模型大鼠的RAF-1蛋白磷酸化水平下调，电针“足三里”、“四白”、“梁门”穴后，RAF-1 蛋白磷酸化水平的量显著升高，且胃黏膜损伤指数明显降低，提示胃黏膜损伤修复实现。针刺对照组的RAF-1蛋白磷酸化水平虽与模型组有差异，表现为一定程度的上调，稍高于模型组，与空白组差异不明显，但对照组的胃黏膜损伤指数与模型组比较无统计学意义提示，针刺对照点并不能明显改善受损的胃黏膜，可能只与一方面对照点的效应有关，另一方面不排除电针的电流效应。同时本实验结果还显示与空白组比较，无水乙醇灌胃造模后，胃黏膜PCNA的量明显减少，提示模型组的细胞增殖被抑制，而电针足阳明胃经后，胃黏膜PCNA显著得到上调，提示电针足阳明胃经 （穴）可促胃黏膜细胞增殖。从而说明RAF-1蛋白的磷酸化促胃黏膜细胞增殖，参与了胃黏膜损伤修复的过程。

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