大孔吸附树脂精制纯化淡竹叶总黄酮的研究

刘 明 吴启南 邵 莹

南京中医药大学，江苏 南京 210046

淡竹叶(Herba Lophatheri)为禾本科(Gramineae)植物淡竹叶(Lophatherumgracile Brongn.)的干燥茎叶。本品性寒，味甘、淡，归心、胃、小肠经，有清热除烦，利尿的功效，用于热病烦渴，小便赤涩淋痛，口舌生疮等症[1]。淡竹叶中含有大量的黄酮、多糖、内酯、叶绿素、氨基酸、维生素和微量元素等成分，其中黄酮类化合物具有较高的生物活性。大孔吸附树脂是近十年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，其稳定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、成本较低。近年来被广泛用于中药成分的精制纯化。本实验以淡竹叶乙醇提取液为对象，通过大孔树脂的筛选实验，探索淡竹叶总黄酮纯化精制的最佳工艺。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

HH-S型水浴锅；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱；AY220型电子分析天平；旋转蒸发仪；日本岛津UV-2401型紫外分光光度计。

1.2 材料

芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号100080-200707。淡竹叶购自浙江省磐安县新渥陈仙芬中药材购销站，产地浙江，批号：20090308；医用酒精；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制[2]

采用硝酸铝一亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品，在507nm处测定。得芦丁浓度C(mg／mL)与吸光度A的回归方程式：A=11.905C+0.0044，R2=0.9994。线性范围：8～48ug/ml。

2.2 供试品溶液的制备及测定

取淡竹叶约100g，石油醚脱脂，18倍量75%乙醇回流提取1.0h[3]，减压浓缩至无醇味，加入适量蒸馏水稀释，静置过夜，3000rpm离心，上清液置250ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，作为供试液备用。移取供试液0.25ml置25ml量瓶中，按标准曲线制备项下的方法，自“各加60%乙醇溶液使成6.0ml”起，依法测定吸光度，测得供试液中总黄酮含量为3.6689mg/ml。移取10ml供试液置蒸发皿中水浴挥干，恒重，测得供试液中总黄酮含量为135.3841mg/g。

2.3 树脂性能考察

2.3.1 大孔吸附树脂的预处理

以乙醇湿法上柱。用95%乙醇溶液在柱上流动清洗，不时检出流出液至乙醇液与水混合（1:5）不呈白色混浊为止，然后以大量蒸馏水洗去乙醇至无醇味。

2.3.2 大孔树脂静态吸附考察

取预处理的7种不同型号的树脂20ml分别置100ml量瓶中，精密移取5ml提取液，加水稀释至50ml，时时振摇，放置18h。滤过，滤液测定吸光度。滤渣中加入85%乙醇50ml，时时振摇，放置18h。滤过，滤液测定吸光度。移取50ml滤液置蒸发皿中水浴挥干，恒重。平行测定2份。按式（1）（2）（3）计算得表1。

表1 静态吸附时不同树脂对总黄酮的影响

2.3.3 大孔树脂动态吸附考察

取预处理的树脂20ml装柱（15mm*300mm），精密移取5ml提取液上样，静置1h。用蒸馏水洗至无色，洗液测定其吸光度。加入85%乙醇溶液洗脱至无色，洗脱液测定吸光度。移取25ml洗脱液置蒸发皿中水浴挥干，恒重。平行测定2份。按式（1）（2）（3）计算得表2。

表2 动态吸附时不同树脂对总黄酮的影响

从表2和表3可以看出HP-20和D-101型大孔吸附树脂吸附率和解吸率均较高，从节约成本角度，故选择D-101大孔吸附树脂进行进一步试验。

2.4 D-101型大孔树脂精制纯化淡竹叶总黄酮工艺参数考察

2.4.1 乙醇溶液洗脱杂质的体积分数梯度考察

取预处理树脂20ml装柱，精密移取2ml提取液上样，静置1h。依次用水、10%、15%、20%、30%的乙醇溶液以2ml/min速度洗脱。洗脱液测定吸光度，移取15ml置蒸发皿中水浴挥干，恒重。平行测定2份。按式（3）计算得图1。

图1 低浓度乙醇梯度洗脱总黄酮含量变化

由图1可知，20%乙醇溶液洗脱液中总黄酮含量增加明显，因此，选用15%乙醇溶液作为杂质的洗脱溶液。

2.4.2 洗脱液体积分数考察

取预处理树脂20ml装柱，精密移取2ml提取液上样，静置1h。用蒸馏水和15%乙醇溶液洗脱杂质。分别用40%、50%、60%、75%、95%的乙醇溶液以2ml/min速度洗脱。洗脱液测定吸光度，精密移取40ml置蒸发皿中水浴挥干，恒重。平行测定2份。按式（3）计算得图2。由图2可知，50%乙醇溶液洗脱黄酮的含量最高，因此，选用50%乙醇溶液为洗脱剂。

图2 不同浓度乙醇洗脱总黄酮含量变化

2.4.3 上柱静态吸附时间考察

取预处理树脂20ml装柱，精密移取2ml提取液上样，分别静置15min、30min、60min、90min。用蒸馏水和15%乙醇溶液洗脱杂质。用50%乙醇溶液洗脱，洗脱液测定吸光度。洗脱速度均为2ml/min。精密移取25ml置蒸发皿中水浴挥干，恒重。平行测定2份。按式（1）（2）（3）计算得表3。由表3可知，60min处的吸附率和解吸率均较高，且其黄酮含量也较高，综合考虑选择60min为上柱静态吸附时间。

表3 上柱静态吸附时间对总黄酮含量的影响

2.4.4 洗脱液体积考察

取预处理树脂10ml装柱，精密移取4ml提取液上样，静置60min。用蒸馏水和15%乙醇溶液洗脱杂质，50%乙醇溶液洗脱。洗脱速度均为2ml/min。每1～2个树脂体积收集一份洗脱液，精密移取测定吸光度。实验结果：5倍量蒸馏水，5倍量15%乙醇溶液，6倍量50%乙醇溶液洗液中总黄酮含量均分别接近于零。因此，可确定上述条件为最佳洗脱体积。

2.4.5 树脂重复上样次数考察

取预处理树脂10ml装柱，精密移取3ml提取液上样，静置60min。用蒸馏水和15%乙醇溶液洗脱杂质，50%乙醇溶液洗脱。洗脱速度均为2ml/min。洗脱液测定吸光度，精密移取一定体积水浴蒸干，恒重。平行测定2份。用95%乙醇溶液洗涤至与水1:5混合不浑浊，用蒸馏水洗至无醇味。重复上样操作4次。4次实验结果显示：吸附率和解吸率均无明显变化，而总黄酮含量不降反升，其中原因有待进一步实验。说明该型号树脂重复使用率较高。

2.4.6 验证试验

取预处理树脂10ml装柱，精密移取3ml提取液上样，静置60min。用蒸馏水和15%乙醇溶液洗脱杂质，50%乙醇溶液洗脱。洗脱速度均为2ml/min。洗脱液吸光度，精密移取10ml置蒸发皿中水浴挥干，恒重。平行测定2份。测得吸附率为81.58%，解吸率为78.08%，总黄酮含量为315.42mg/g。

3 讨论

通过大孔树脂的动态和静态吸附考察，确定D-101型大孔吸附树脂比较适合于淡竹叶总黄酮的精制纯化。工艺条件为：上柱保持60min，2ml/min速度洗脱，5倍量水、5倍量15%乙醇溶液洗脱杂质、6倍量50%乙醇溶液洗脱。总黄酮的纯度由原来的135.38mg/g上升至315.42mg/g。其结果经验证试验确认该条件可行，可以作为工业生产的参考工艺条件。

[1]江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海：上海科学技术出版社，1977：2253-2254.

[2]国家药典委员会.中国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2005：附录28.

[3]宋秋烨，陈梅，吴启南.淡竹叶总黄酮提取工艺研究[A].中国中医药信息杂志，2007，14(3)：14.