RNA干扰沉默雄激素受体基因对前列腺癌细胞生长的抑制作用研究*

王洛夫,张 尧,兰卫华,靳风烁,江 军

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科,重庆400042)

前列腺癌具有雄激素依赖性,抗雄激素治疗至少对80%的晚期前列腺癌有效,但绝大多数患者会在短期内发展为雄激素非依赖性前列腺癌,缺乏有效的治疗方法[1-2]。目前有研究认为,前列腺癌的雄激素依赖性主要是雄激素受体(androgen receptor,AR)依赖性,AR不但在雄激素依赖性前列腺癌中具有重要作用,在雄激素非依赖性前列腺癌中也起着关键作用[3-4],因此,可针对 AR基因进行前列腺癌的基因治疗。RNA干扰(RNAi)具有高效、高度基因特异性的特点,能沉默所有已知序列的基因,采用 RNA干扰技术沉默AR基因,将可能有效地抑制AR的表达,从而抑制前列腺细胞的生长。因此,本研究拟设计合成针对AR基因的小干扰RNA(siRNA)并转染前列腺癌细胞,观测其对AR基因的沉默作用及对前列腺癌细胞的生长抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料 实验选用人前列腺癌细胞株LNCaP(购自美国ATCC),该细胞表达 AR,具有雄激素依赖性,同时该细胞对雌激素、孕激素甚至抗雄激素药物敏感,具有雄激素非依赖性前列腺癌的特性。siRNA合成试剂盒Silencer·siRNA Construction Kit、siRNA转染试剂 siPORTTMLipid Transfection Agent购自美国 Ambion公司,ReverTra Ace-α-逆转录试剂盒购自TOYOBO公司。

1.2 AR siRNA的设计 利用Ambion公司提供的siRNA设计软件设计针对 AR cDNA(GeneBank序列号:M23263 N18624)符合特征的靶序列,同时设计阴性对照序列(GC含量与靶序列相同)。经初步分析选取了3个靶序列:5′-AAT GCA AAG GT T CTC TGC TAG-3′(位于 Exon1),5′-AAG GTC TTC TTC AAA AGA GCC-3′(位 于 Exon2),5′-AAA GTC AAG CCC ATC TAT TTC-3′(位于 Exon8);阴性对照序列 :5′-AAG TGC GAT CTA ACT GAC CTA-3′。 根据靶序列设计用于合成siRNA的寡核苷酸模板,反义链为靶序列,正义链为靶序列的互补序列,3′加T7启动子引物序列CCTGTCTC。以上寡核苷酸模板均由上海生工生物工程公司合成。

1.3 AR siRNA的制备 采用 Ambion公司的Silencer·siRNA Construction Kit合成上述AR siRNA,按试剂盒操作说明书取等摩尔浓度的正、反义寡核苷酸模板与T7启动子混合,70℃加热混合物5min,室温下放置5min,T7启动子和寡核苷酸模板序列退火结合,然后用DNA聚合酶Klenow大片段补齐成为可用于转录的双链DNA模板,分别用T7 RNA聚合酶进行体外转录,再将产物混合后于37℃水浴箱持续孵育过夜,形成双链RNA。以DNA酶降解模板,同时用单链专一的核糖核酸酶(RNase)消化5′的引导序列,由于 RNase不能切开 U碱基,也不能降解双链 RNA,所以得到的产物就是所需的21bp的双链 siRNA,有19对碱基互补,3′端各有2个 U突出。按试剂盒操作说明书进行纯化,得到的siRNA用去核酸酶的水溶解,紫外分光光度计定量,-20℃保存备用。将3种靶序列合成的AR siRNA依次命名为AR siRNAⅠ、AR siRNAⅡ、AR siRNAⅢ。

1.4 AR siRNA转染前列腺癌细胞 取对数生长期LNCaP细胞接种于6孔板(5×105/孔),培养细胞至密度为50%～60%。采用siPORTTMLipid T ransfection Agent进行siRNA转染,简要步骤如下:取4μ L siPORTTMLipid Transfection A-gent,加入OPTI-MEM Ⅰ reduced serum medium使终体积为15μ L,充分混匀,室温孵育 10～30min。用OPTI-MEM Ⅰ reduced serum medium稀释 siRNA至终体积 185μ L(终浓度25nM)。将稀释的siRNA加入到稀释的siPORTTMLipid Transfection Agent中,室温孵育 15～20min。用 OPTI-MEMⅠreduced serum medium将细胞洗一遍,然后加入新鲜的OPTI-MEM Ⅰ 至800μ L。加入 siPORTTMLipid T ransfection A-gent/siRNA复合物至每孔,使终体积为1 000μ L,在常规细胞培养条件下孵育4h,加1～2mL新鲜的常规培养基继续培养。每种AR siRNA转染重复3次,观察细胞生长状况,挑选对LNCaP抑制作用最强的一组AR siRNA进行下一步实验。

1.4 AR siRNA对AR基因转录的影响 实验分3个组,A组:以抑制作用最强的AR siRNA转染LNCaP,称为 AR siRNA干预组;B组:以阴性对照siRNA转染LNCaP,称为无关对照组(mock control);C组:只加脂质体,称为空白对照组(control)。转染48h后,采用 Trizol试剂(Invitogen)提取细胞总RNA,用DNA酶消化后,电泳证实提取 RNA成功,以随机六聚体引物反转录为 cDNA,反应条件:42℃、10min→30℃、20min→99℃、5min→4℃、5min,然后以 A R 引物 P1、P2 进行PCR,以 GAPDH 作为内参照,引物序列:P1 5′-AAG CCA TTG AGC CAG GTG TAG TG-3′,P2 5′-AAC CAG ATC AGG GGC GAA GTA GA-3′,GAPDH 引物:5′-ACC CAT CAC CAT CTT CCA GGA G-3′(上 游 引 物),5′-GAA GGG GCG GAG ATG ATG AC-3′(下游引物),反应条件:94℃、5min→(94℃、30s→58℃、30s→72℃、30s)×28→72℃、10min,扩增片段的长度 AR为 275bp,GAPDH为159bp。PCR产物采用图像扫描仪拍照并进行灰度分析,以AR/GAPDH的比值代表相对含量。

1.6 细胞生长曲线 接种LNCaP于24孔板,每孔接种3×104个细胞,24h后按上述分组进行转染,次日开始每天消化3孔记数,取平均值,绘制细胞生长曲线,计算细胞生长抑制百分率,计算公式:细胞生长抑制百分率(%)=(Nn-N)/(Nn-N0)×100%。其中N0为始接种细胞数,N为AR siRNA干预组细胞接种n天后的细胞数,Nn为对照组细胞接种n天后的细胞数。

2 结 果

2.1 siRNA的合成 采用Ambion公司的Silencer·siRNA Construction Kit合成的 AR siRNA是双链 RNA,长度为21bp,经凝胶电泳证实成功合成了AR siRNA(图1)。

2.2 AR siRNA转染前列腺癌细胞及其对前列腺癌细胞生长的影响 将合成的3种AR siRNA转染前列腺癌细胞LNCaP,与阴性对照和空白对照相比,发现3种A R siRNA对LNCaP细胞均有不同程度的抑制作用,但以AR siRNAⅡ对LNCaP细胞的生长抑制作用最强,表现为细胞生长停滞、脱壁,而对照组细胞生长旺盛,故选择AR siRNAⅡ进行进一步的研究(图2)。

2.3 AR siRNA对AR基因转录的影响 为明确AR siRNAⅡ转染对靶基因的影响,本科进行了RT-PCR。结果表明,AR siRNAⅡ转染 LNCaP细胞48h后,AR mRNA水平明显下调,与空白对照组和无关对照组相比差异有统计学意义〔(0.302±0.028)vs(0.494±0.032),P＜0.01;(0.302±0.028)vs(0.534±0.034),P＜0.01〕,而无关对照组不引起靶基因AR mRNA水平的明显变化〔(0.534±0.034)vs(0.494±0.032),P＞0.05〕,见图 3。

图1 合成的AR siRNA凝胶电泳(1%琼脂糖凝胶)结果

图2 各组细胞生长情况(光镜 ×100)

图3 RT-PCR产物凝胶电泳(1%琼脂糖凝胶)结果

图4 细胞生长曲线

2.4 细胞生长曲线 按上述分组绘制细胞生长曲线(图4),可见AR siRNA干预组细胞生长明显被抑制,细胞生长抑制率(相对空白对照组)为78.2%。

3 讨 论

前列腺癌是西方工业国家最常见的恶性肿瘤之一,是美国男性常见的恶性肿瘤,其死亡率仅次于肺癌,居男性癌症死亡的第2位;中国前列腺癌的发病率也呈上升趋势。前列腺癌具有雄激素依赖性,抗雄激素治疗至少对80%的晚期前列腺癌有效,但绝大多数患者会在短期内发展为雄激素非依赖性前列腺癌,缺乏有效的治疗方法[1-2]。

目前,研究认为,前列腺癌的雄激素依赖性主要是AR依赖性,AR不单在雄激素依赖性前列腺癌中具有重要作用,在雄激素非依赖性前列腺癌中也起着关键作用[3-4],表现在:(1)AR表达增加,几乎所有雄激素非依赖性前列腺癌均表达AR,且大多数病例高于原发性肿瘤。AR表达增加的机制之一是AR基因扩增,在进行抗雄激素治疗后发生雄激素非依赖性转变的前列腺癌患者,约30%有AR基因扩增。A R表达增加使得在低浓度雄激素环境中雄激素-雄激素受体通路仍可被激活。(2)AR基因突变,突变的AR可被雄激素以外的甾体激素激活。(3)生长因子或细胞因子以配基非依赖的方式激活。(4)过量表达AR共激活因子,如ARA-70等,使 AR的活性大幅度提高。这些细胞尽管对抗雄激素治疗抵抗,但却对AR具有高度依赖性,因此,阻断这些细胞的AR表达应该可以起到治疗作用。这对攻克雄激素非依赖性前列腺癌这一前列腺癌治疗领域的难题无疑是有益的尝试。Eder等[5]采用AR反义寡核苷酸阻断AR蛋白表达,抑制了前列腺癌细胞LNCaP的生长,本科采用逆转录病毒载体介导的 AR反义RNA抑制AR表达也取得了类似的结果[6-7]。因LNCaP具有雄激素非依赖性前列腺癌的一些特性,如在无雄激素的环境中,雌激素、孕激素、细胞因子等仍能通过激活AR而使LNCaP生长。因此,上述研究表明AR在雄激素非依赖性前列腺癌的治疗中极具价值。但这些实验中反义核酸对AR表达的抑制程度及对前列腺癌细胞的生长抑制程度仍偏低,仍需寻找更有效的方法。

RNA干扰是一种在细胞内导入与特定基因序列相同的双链RNA(dsRNA)而特异关闭基因的方法,即用20多个核苷酸组成的siRNA代替传统反义核酸进行转录后基因沉默,目前该技术已经迅速而广泛地应用到基因功能、基因表达调控机制研究等热门领域,并为基因治疗开辟了新的途径[8-9]。RNAi具有高效、高度基因特异性的特点,能沉默所有已知序列的基因,且RNA干扰在基因沉默方面比反义RNA和反义寡核苷酸更有效。因此,设计合成针对AR的特异dsRNA并导入到前列腺癌细胞,使AR基因沉默,将可能更有效地抑制AR的表达,从而抑制前列腺癌细胞的生长。所以,本研究在既往研究的基础上,选用RNA干扰技术沉默雄激素受体基因。

通过设计、合成多个AR siRNA,转染前列腺癌细胞LNCaP,本研究筛选出了一个对其生长抑制作用最强的AR siRNA,RT-PCR证实前列腺癌细胞的AR mRNA水平显著降低,LNCaP细胞生长被显著抑制,细胞生长抑制率为78.2%。以上结果表明AR siRNA可沉默AR基因,并进一步抑制前列腺癌细胞的生长。由于LNCaP存在基因突变,雌激素、孕激素甚至抗雄激素药物可刺激其生长,具有雄激素非依赖性前列腺癌的一些特征,故本研究结果提示AR siRNA可能对雄激素非依赖性前列腺癌也有生长抑制作用。

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