舒冠滴丸对高脂血症大鼠缺血再灌注损伤心肌ICAM-1表达的影响

王建湘,程丑夫,邓满霞

许多研究表明,炎症反应参与了心肌缺血再灌注损伤(my- ocardial ischemia reperfusion injury,MIRI),其中中性粒细胞(PM N)浸润是介导该炎症反应的主要媒介[1]。在再灌注早期(即＜1 h),大多PMN黏附于血管内皮细胞并引起内皮损伤,间接导致心肌损伤;随着再灌注时间的延长,更多PMN移动到血管外并黏附在心肌细胞上,参与心肌细胞损伤。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在内皮及心肌细胞中的诱生对PMN介导的缺血再灌注损伤至关重要[2]。ICAM-1通过诱导PMN黏附在内皮细胞和内皮下基质并穿过内皮迁移流入缺血区,通过阻塞微血管、释放氧自由基等机制导致心肌细胞损伤,使梗死过程加剧。舒冠滴丸具有芳香通脉、益气温阳、豁痰化瘀功效,前期研究证实[3,4],舒冠滴丸能抑制内皮细胞ICAM-1mRNA异常表达,对高脂血清损伤的内皮细胞具有保护作用;具有调节血脂代谢紊乱,减少动脉内膜斑块数量,消退和稳定动脉粥样硬化(AS)斑块,降低血浆sCD40L、可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)水平,其作用可能与抑制AS斑块炎症反应有关。本研究拟建立高脂血症大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,观察舒冠滴丸对缺血再灌注损伤心肌ICAM-1表达的影响,并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠,体重 180 g～200 g,由湖南中医药大学医学实验动物中心提供,医学实验动物合格证号:医动字第20-007号,于清洁级饲养室适应性饲养1周后用于实验。

1.2 药品与试剂、仪器 舒冠滴丸由冰片、鹅不食草、丁香、肉桂、红参、白芥子、三七等中药制成滴丸,每粒 50 mg,由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供,批号:20061128,用 2×DMEM/F12稀释成20 mg/mL,抽滤灭菌,4℃保存备用;辛伐他汀片,每片20 mg,由杭州默沙东制药有限公司提供,批号:20080321;胆固醇、胆酸钠(武汉亚法生物技术有限公司);甲基硫氧嘧啶(上海复星朝晖药业有限公司);丙二醇(上海生物工程有限公司);小鼠抗人-ICAM-1单克隆抗体(Zymed公司,USA);SP试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉生物科技股份有限公司);总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(北京中生生物工程高技术公司);高速冷冻离心机(Beckman Allerga 25R);光学显微镜(江苏净化设备厂);CL-7200全自动生化分析仪(日本岛津公司);HX-200动物呼吸机(成都太盟科技有限公司);Image-Pro Plus 4.5图像分析系统(Olympus公司,Japan)。

1.3 大鼠高脂血症模型的建立 根据文献[5]的方法,健康雄性Wistar大鼠,在基础饲料喂养的基础上,予配制的脂肪乳高脂饮食10 mL/(kg◦d)连续灌胃14 d即可造成高脂血症模型。

1.4 实验分组及处理 Wistar大鼠70只,随机分成7组,每组10只。空白对照组:常规饲养,不做任何处理;模型组:每天给予生理盐水10 mL/kg灌胃;假手术组:手术措施同模型组,只穿线不结扎冠状动脉,每天给予生理盐水10 mL/kg灌胃;舒冠滴丸高剂量组:手术措施同模型组,每天给予舒冠滴丸250 mg/kg灌胃;舒冠滴丸中剂量组:手术措施同模型组,每天给予舒冠滴丸125 mg/kg灌胃;舒冠滴丸低剂量组:手术措施同模型组,每天给予舒冠滴丸50 mg/kg灌胃;阳性药物对照组:手术措施同模型组,每天给予辛伐他汀5 mg/kg灌胃。高脂血症大鼠不同处理因素持续灌胃14 d,末次给药后1 h用于实验。

1.5 在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立 按文献[6]方法,腹腔注射1%戊巴比妥钠(4 mL/kg)麻醉。麻醉后仰卧位固定四肢及头部于手术台上,连接心电电极记录Ⅱ导联心电图。行颈部正中切口分离气管,穿线备用,气管插管,连接小动物呼吸机(室内空气,潮气量2 mL/100 g,呼吸频率60/min)。于心尖搏动处纵行分离皮肤、肌层,剪断2肋～4肋,分离心包膜,轻轻挤压胸廓,暴露心脏,掀起左心耳,于左心耳根部下方肺动脉圆锥旁以5/0带弯针尼龙缝线迅速穿过冠脉下方,将心脏放回胸腔。稳定10 min后,提拉穿过小塑料管的缝线两端,将塑料管压向心肌表面,用止血钳夹住小管及其中缝线以结扎冠脉造成心肌缺血,45 min后松开止血钳以形成再灌流,120 min再灌注后结束实验。模型复制成功的标准:结扎后Ⅱ导联心电图以J点或ST段明显抬高或QRS波增高、增宽与T波融合,呈弓背向上单向曲线为心肌缺血成功复制;放松结扎线后,抬高的ST段下降1/2以上为再灌注成功复制。

1.6 心肌组织HE染色 实验结束后,将大鼠立即处死取心,切取左心室于10%甲醛中常规固定,流水冲洗,经各级乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片,HE染色,中性树胶封片,于光镜下观察。

1.7 心肌组织ICAM-1免疫组化测定 取心肌组织标本常规脱蜡至水,免疫组化染色采用S-P法,利用小鼠抗人ICAM-1单克隆抗体严格按文献[7]报道方法和试剂盒说明书进行心肌组织ICAM-1免疫组化测定,DAB显色剂显色,苏木素轻度复染,中性树胶封片。实验以PBS代替一抗进行反应作阴性对照。通过ALTA U2图像采集卡采集图像,Image Pro Plus 4.5图像分析系统进行计算机图像分析,统一参数设定保持基线一致,其阳性追踪点为表达于胞浆或胞膜的棕黄色定位。每张切片随机观察10个视野,计算切片各视野阳性点面积总和及光密度均值,以阳性点面积总和/阳性点光密度均值表示阳性表达强度。

1.8 血脂检测 实验结束前心脏取血2 mL,3 000 r/min离心15 min后取上清,-20℃保存,标本收集结束后由CL-7200全自动生化分析仪测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.9 统计学处理 采用SPSS 13.0统计学软件进行处理,数据以均数±标准差(±s)表示,各组间数据显著性检验采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组缺血再灌注损伤大鼠心肌病理形态学变化 光镜下见模型组心肌纤维排列紊乱,呈波浪状,部分区域有断裂,胞浆嗜酸性增强,可见空泡样变,心肌间质严重水肿,有少量炎性细胞;辛伐他汀组心肌纤维排列基本整齐,空泡变性减轻,心肌间质轻度水肿;舒冠滴丸组心肌细胞排列基本整齐,心肌纤维排列基本整齐,空泡变性减轻,心肌间质水肿不明显,炎细胞浸润减少。辛伐他汀组病理改变与舒冠滴丸高剂量组相近。

2.2 各组大鼠心肌组织ICAM-1蛋白表达变化 模型组心肌组织ICAM-1蛋白表达显著高于假手术组(P＜0.01),说明MIRI使ICAM-1表达增强。与模型组比较,舒冠滴丸各剂量组ICAM-1蛋白表达量均降低(P＜0.05)。辛伐他汀组心肌ICAM-1蛋白表达量与舒冠滴丸高剂量组相近,空白组和假手术组比较,大鼠心肌ICAM-1蛋白表达无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 各组ICAM-1表达变化的比较(±s)

表1 各组ICAM-1表达变化的比较(±s)

组别 n ICAM-1空白组 10 103.35±155.72假手术组 10 105.47±156.45模型组 10 352.41±215.291)舒冠滴丸高剂量组 10 172.43±154.722)舒冠滴丸中剂量组 10 173.35±160.912)舒冠滴丸低剂量组 10 175.48±156.352)辛伐他汀组 10 175.21±156.832)与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.05

2.3 各组大鼠血脂含量变化 与空白组比较,模型组血清TC、TG、LDL-C含量明显升高(P＜0.01),HDL-C含量明显下降(P＜0.01),表明大鼠高脂血症模型复制成功。与模型组比较,舒冠滴丸高剂量和中剂量组可明显降低血清TC、TG、LDL-C(P＜0.05),升高HDL-C(P＜0.05),舒冠滴丸低剂量组和模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05);辛伐他汀组血脂与舒冠滴丸高剂量组比较差异无统计学意义(P＞0.05);假手术组和模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表2。

表2 舒冠滴丸对MIRI大鼠血脂含量的影响(±s)mmol/L

表2 舒冠滴丸对MIRI大鼠血脂含量的影响(±s)mmol/L

组别 n TC TG HDL-C LDL-C空白组 10 5.29±0.59 0.56±0.03 1.62±0.05 1.05±0.07假手术组 10 11.23±1.05 1.67±0.06 0.86±0.17 1.64±0.02模型组 10 11.29±1.411) 1.69±0.021) 0.87±0.011) 1.63±0.011)舒冠滴丸高剂量组 10 7.91±1.672) 0.96±0.082) 1.28±0.022) 1.15±0.072)舒冠滴丸中剂量组 10 8.43±0.012) 1.08±0.082) 1.19±0.042) 1.24±0.042)舒冠滴丸低剂量组 10 10.27±0.18 1.41±0.05 0.91±0.13 1.45±0.03辛伐他汀组 10 7.74±0.022) 0.81±0.082) 1.33±0.042) 1.09±0.042)与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

近年来,中性粒细胞和血管内皮细胞的黏附、白细胞的聚集在缺血再灌注损伤发生中的重要性已被认识,特别是黏附分子的研究已受到广泛重视。在心肌缺血再灌注期间有大量炎性细胞特别是中性粒细胞在微血管出现聚集乃至堵塞中断血流,这是由于微血管内皮细胞与炎性细胞发生黏附反应的结果。ICAM-1又称CD45,属于免疫球蛋白超家族的一员,为19号染色体基因编码的单链跨膜糖蛋白,其核心多肽分子量为55 000。它作为白细胞功能相关抗原、巨噬细胞分化抗原-1的配体,参与白细胞与血管内皮细胞的黏附并向血管外迁移,黏附心肌细胞释放细胞毒,表达增强的ICAM-1还可反馈作用于内皮细胞、巨噬细胞,促进细胞因子等炎症介质的表达。国外研究发现[8],MIRI中ICAM-1表达明显升高,且与心肌损伤密切相关。正常情况下,血管内皮细胞和心肌细胞仅表达极少量的ICAM-1,而在缺血再灌注时,ICAM-1可在核转录因子-κ B(NF-κ B)、活性蛋白-1(AP-1)、白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等作用下表达量成倍增加[9]。ICAM-1的高表达可刺激中性粒细胞与内皮细胞黏附,介导其对心肌细胞的浸润,引起并加剧心肌细胞的损伤,导致细胞死亡。有研究表明[10,11],心肌缺血1 h后再灌注1 h,在缺血心肌中可检出ICAM-1mRNA,且随再灌注时间延长而表达增加,而再灌注3 h,非缺血心肌仍无明显ICAM-1mRNA表达。Niessen等[12]研究认为AMI心肌细胞中ICAM-1高表达,若抑制其表达,可减小梗死面积。而应用ICAM-1特异性抗体可以减少再灌注后的心肌损伤和心肌梗死面积[12]。本研究发现,缺血45 min再灌注2 h后模型组心肌组织ICAM-1蛋白表达显著高于假手术组(P＜0.01),说明MIRI使ICAM-1表达增强;与模型组比较,舒冠滴丸各剂量组ICAM-1蛋白表达量均降低(P＜0.05),提示其可以降低大鼠MIRI心肌ICAM-1蛋白表达量,减轻PM N浸润,抑制其炎症反应。

高脂血症是冠心病的独立危险因素之一,是动脉粥样硬化性疾病的重要病因。本研究通过改变动物的饮食习惯,成功地建立了食源性大鼠高脂血症模型,并在此基础上采用结扎冠脉左前降支的方法,制备成大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,此动物模型的心电图演变、心肌酶学改变及组织病理形态学变化均与人类发生急性心肌梗死接近[13],能高度模拟临床冠心病的发生发展及治疗过程,使实验结果更具有临床指导意义。本研究发现,模型组大鼠血清 TC、TG、LDL-C的含量均明显升高,而HDL-C显著下降,说明模型组大鼠存在着血脂代谢紊乱,通过舒冠滴丸干预治疗,结果显示可以显著降低高脂血症模型大鼠血清 TC、TG、LDL-C的水平,明显提高血清 HDL-C的水平,表明舒冠滴丸可有效地纠正高脂血症大鼠的脂质代谢紊乱。

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