盐酸胍消化法用于结核杆菌不同检样前处理及结果分析

陈 曼,祝 绚,谭积善,胡启飞,吴民泸,段佳慧,代 娟,赖 翼

(1.成都医学院医学检验系,四川成都610083;2.成都市第九人民医院,四川成都610015;3.成都军区总医院,四川成都610083;4.成都第一制药厂,四川 成都610504)

肺结核病是严重威胁人类健康的重大传染性疾病之一,“是单病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病”[1],但只要能早期诊断合理用药,绝大多数的结核病人可以治愈。因此提高诊断阳性率和诊断速度对于防治结核病具有重要意义[2]。现有的结核病实验室诊断方法阳性率普遍较低[3]。荧光定量PCR(FQ-PCR)能够快速检出结核杆菌,但是在不同的样品中阳性率差异较大,特别是对于有污染的样品,常常发现有抑制现象[4]。本文通过自制的盐酸胍消化液对样品进行处理,希望提高在不同样品中的结核杆菌的检出率,以期对肺结核病人的早期诊断及治疗。

1 材料和方法

1.1标本来源收集成都医学院附属第一人民医院、成都军区总医院和成都第九人民医院临床疑是肺结核病患者标本185份,男 124例,女61例,年龄在20-75岁之间。标本类型有痰液、血液、尿液、脓液、胸腹水、肺泡灌洗液和心包积液等。

1.2主要仪器中山大学达安基因股份有限公司生产的DA7600型实时荧光定量PCR仪。

1.3主要试剂

1.3.1盐酸胍消化液 自制(5 mol/L盐酸胍,50 mmol/L Tris-CI pH7.5,25 mmol/L EDTA和0.1 mol/Lβ-巯基乙醇)。

1.3.2结核分支杆菌(TB)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒,结核分支杆菌阳性定量参考欠,购于中山大学达安基因股份有限公司;L-J培养基购于成都飞奥生物技术有限公司。

1.4方法

1.4.1将各种类型的标本分成相同的2份,为对照组,按照医院的常规方法涂片镜检和培养,并按照试剂盒书说明提取DNA,另一份对不同标本处理如下:血液加入等体积的盐酸胍消化液混合,对部分有凝块样品,37°孵育20 min。加入10 ml无菌水混合 ,室温 10 min,5 000-6 000 g,离心15 min,保留沉淀物。

痰加2倍体积的盐酸胍消化液,漩涡30 s,加入10 ml无菌水混合,室温10 min,对有血污染、高脓性和粘液性的痰标本,室温多放置10 min,5 000-6 000 g,离心15min,保留沉淀物。

其他EDTA抗凝管收集胸腹水,防止凝块形成,5 000-6 000 g,离心10min,然后沉淀物按照痰标本方式加工;乳状标本,25 000 g离心后,用一个无菌棉试子除去脂肪,沉淀物用2倍体积的盐酸胍消化液清洗2次,然后用无菌水洗;很粘稠的标本,加入2倍体积的盐酸胍消化液,漩涡混合,37°孵育15-30 min,加入10 ml无菌水,离心;脑脊液标本,25 000 g离心,先用盐酸胍消化液清洗,然后水洗。所有标本离心后保留沉淀物。

1.4.2显微镜检和培养 沉淀用500 μ l无菌水再悬浮,取 50 μ l用于直接涂片镜检 ,另取 225 μ l接种在L-J培养基上。

1.4.3DNA 提取 225 μ l加入1.5 ml管中离心,20 000 g,5 min,加入50 μ l DNA 提取液(试剂盒自带),100℃恒温处理10 min后离心取上清2 μ l至PCR反应管内。

1.4.4FQ-PCR检测 将制备好的所有DNA模板与阴阳性对照及阳性标准品一同扩增,按照试剂盒要求93℃2 min,93℃45 s,55℃60 s反应10个循环,93℃30 s,55℃45 s,30个循环。反应结束后存盘分析结果,阳性判断的标准为增长曲线呈典型S型,最强荧光值较基础荧光值增高20单位以上。

1.5统计学处理采用 χ2检验进行数据统计。

2 结果

2.1培养结果的比较经盐酸胍消化液处理后的样品没有丧失结核杆菌的繁殖能力,两种方法阳性结果的一致率为100%。对照组培养的标本在16天内菌落成阳性,而用盐酸胍消化液处理的细菌有2-3天的延后,同时细菌数略低于对照组,但是两者没有可评估的差异。

2.2涂片镜检对照组涂片抗酸染色镜检发现阳性数12例,阳性率6.49%,经盐酸胍消化液处理后的标本,涂片发现阳性数25例,阳性率13.51%,两者比较 χ2=5.075,P＜0.05,差异有统计学意义,特别是对于有血污染的,脓性的,粘液性的标本,直接涂片的标本较厚,且背景污染严重。经盐酸胍消化液处理后,没有改变细菌的染色性质及完整性。

2.3不同检样中FQ-PCR的阳性率比较用盐酸胍缓冲液处理后的样品FQ-PCR阳性检出数普遍高于试剂盒的方法,同时与培养结果的一致性也高于试剂盒的方法。经两种方法处理后,总阳性数相比差异有统计学意义,P＜0.01。其中,血液、尿液、胸腹水、脑脊液标本比较,χ2值分别为9.88、6.09、5.28、6.49,P＜0.05,差异有统计学意思,而其他类型标本没有发现统计学上有意义的差异。血液标本的差异最大,结果见表1。

表1 不同检样中两种处理方法的FQ-PCR阳性率比较

3 讨论

对结核病人的实验室诊断,常规的镜检法、培养法及PCR法,受标本中细菌数及抑制物质的干扰,敏感度不高一直困绕临床医生和检验人员[5]。除了方法本身的因素外,标本的留取和前处理将直接影响检测的灵敏度和结果的准确性。在临床工作中,标本常直接或浓缩集菌后用于镜检和培养。而定量PCR,对标本的处理是试剂盒常用的NaOH法,但碱消化法影响菌体活性而不适用于培养[6]。

对结核的检测,常会根据病变部位收集相应的标本,各类标本间的细菌量和内容物都相差很大。目前的标本处理的方法经研究对痰液和肺泡灌洗液的加工较好[7],常规方法敏感性较高,但对血液、脑脊液等的敏感性较低[8],因此急需一种适用于各类标本的能用于常规结核菌检出的标本加工方法。

本文采用自制的盐酸胍消化液对各类标本进行处理,盐酸胍消化液是一种中性促溶剂,因此不需要再对它进行中和。实验证明,经盐酸胍消化液处理后的标本能够增加每张玻片镜检时的细菌量,在不改变细菌的染色性和完整性的同时有效去除细胞碎片和背景污染,从而提高涂片染色镜检的敏感性。经L-J培养后,显示了较强的生长能力,与对照组标本相比,没有显示出可评估的差异。

FQ-PCR应用于临床以来,多数试剂盒受标本中抑制物的影响。用盐酸胍消化液处理后的各类样品FQ-PCR的阳性率普遍提高于,同时与培养结果的一致性也高于单纯用试剂盒的方法。对血液、尿液、胸腹水、脑脊液等常规方法捡出率较低的标本显示出了更高的阳性率,而其他类型标本没有发现统计学上有意义的差异。

以上研究结果表明盐酸胍消化液能从多种临床物质中分离出无抑制的高质量的分支杆菌DNA,是一种快速、简单的和廉价的方法,适用于多种类型的实验室标本。

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