Mfn2基因克隆及pEGFPmfn2真核表达质粒的构建

席少静,何 军,滕艳萍,王晓婕,范 倩

(1.宁夏医科大学,宁夏 银川750004;2.宁夏医科大学附属医院 心脏中心,宁夏 银川750004)

线粒体融合蛋白2基因(mitofusin-2,mfn2)是近年来发现的一种新型基因,该基因位于线粒体的外膜,参与线粒体的融合,调节线粒体的新陈代谢和维持线粒体的网状结构。Mfn2不仅在血管平滑肌细胞(VSMC)中表达,在心、脑 、肺 、肾、肝组织中亦有广泛分布。陈光慧等[1]发现该基因可以有效地阻遏细胞周期和抑制细胞增殖,是一种新发现的增殖抑制基因。增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是绿色荧光蛋白(GFP)的一种突变体,能在异源组织中表达并产生荧光,已作为报告基因广泛运用于生物医学研究领域。本文通过大鼠pEGFPmfn2荧光真核表达载体的构建,为下一步转染VSMC,进一步研究mfn2抑制VSMC的增殖作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株与质粒 大鼠血管平滑肌细胞株A7r5引自ATCC(CRL-1444);pGEM-T载体购自promega公司,pEGFP-N1载体购自CLONTECH公司。

1.1.2主要试剂 E.Coli DH5α感受态细胞、质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技公司,DMEM培养基、胎牛血清、PBS缓冲液、0.25%Trypsin+0.02%EDTA购自美国Hyclone,TRIzol Reagent购自Invitrogen,RT试剂盒、限制性内切酶HindⅢ和 BamHⅠ、T4DNA连接酶、DNA Marker购自美国Fermentas,Hot-StarTaqDNA聚合酶购自TaKaRa,DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen,引物合成和测序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及总RNA的提取 引自ATCC的A7r5,以1∶2接种于新的培养瓶中,放入37℃、5%CO2培养箱中培养,约3-5天传代一次。取一瓶长至对数生长期的细胞,TRIzol法提取A7r5总RNA,测定总RNA浓度并行1%琼脂糖凝胶电泳,观察总RNA的完整性。

1.2.2mfn2基因的扩增和回收 根据GenBank数据库得到大鼠mfn2基因cDNA序列(收录号:NM1-30894),通过Primer软件设计引物,在上下游引物 5′端分别加入限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切位点及保护碱基,用于定向克隆。上游引物5′-AGAAGCTTATGTCCCTGCTCTTTTCTC-3′;下游引物 5′-TAGGATCCCGTCTGCCGGGCTGCAG-3′,扩增 产物 长度为2 274 bp。取A7r5总RNA 3 μ g逆转录合成cDNA,取 5 μ l cDNA 行 PCR。扩增条件:95℃5 min、72℃10 min;变性和延伸条件分别为95℃30 s,55℃45 s,72℃1.5 min,5个循环;95℃30 s,64℃45 s,72℃2.5 min,35个循环。1%琼脂糖凝胶电泳分离特异性产物,按DNA凝胶回收试剂盒说明书回收并测定PCR产物浓度。

1.2.3重组克隆载体的构建 将回收的mfn2cDNA与载体pGEM-T连接成重组克隆载体pGEM-T-mfn2。10 μ l连接体系含纯化 PCR 产物 3 μ l,载体 pGEM-T 1 μ l,T4DNA 连接酶1 μ l,10×Buffer 2 μ l,混匀后4℃连接反应过夜。将连接产物10 μ l转化入 E.coli DH5α感受态细胞并行氨苄青霉素(100 mg/L)筛选,以未转染菌和转染载体pGEM-T菌为对照,采用菌落直接PCR、HindⅢ和BamHⅠ双酶切和序列分析方法,确定目标片段的存在和序列正确性。

1.2.4重组真核表达载体的构建 将转化重组质粒pGEM-T-mfn2的E.coli DH5α增菌后,提取重组质粒行HindⅢ和BamHⅠ双酶切。酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后将目的片段行胶回收并测定浓度,与经相同双酶切的载体pEGFP-N1连接成重组表达载体pEGFPmfn2。20 μ l连接体系含回收产物 5 μ l,载体pEGFP-N1 1 μ l,T4DNA 连接酶 1 μ l,10 ×Buffer 2 μ l,混匀后4℃连接反应过夜。将20μ l连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞并行卡那霉素(25 mg/L)筛选,以未转染菌和转染载体pEGFP-N1菌为对照,经菌落直接PCR、HindⅢ和BamHⅠ双酶切途径确定目标片段的存在。将初步鉴定为阳性克隆菌株送至上海生工生物工程公司进行核苷酸序列测定。

2 结果

2.1 培养的A7r5细胞

倒置显微镜下见A7r5细胞呈成纤维细胞样,贴壁生长(图1)。

图1 培养48小时的A7r5细胞

2.2 A7r5总RNA的电泳结果

A7r5总RNA电泳后显示三个条带,28 s、18 s、5 s,提示提取的总RNA是完整的(图2)。

图2 A7r5总 RNA的电泳结果

2.3 Mfn2基因的克隆与扩增

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示存在约为2.2 kb的特异性条带,与目的片段(2 274 bp)大小相似,提示Mfn2基因cDNA已获成功扩增(图3)。

图3 mfn2目的基因的扩增

2.4 重组质粒pGEM-T-mfn2的构建与鉴定

1为阴性对照,2为重组克隆载体pGEM-T-mfn2阳性菌落直接PCR显示存在2.2 kb的特异性条带,3为HindⅢ和BamHⅠ双酶切得到2.2kb目的条带和3.0kb的pGEM-T载体,4为HindⅢ单酶切得到的5.2 kb的重组质粒,5为重组质粒未经酶切的电泳图,提示pGEM-T-mfn2重组质粒获成功构建(图4)。

图4 重组克隆载体pGEM-T-mfn2的鉴定

2.5 重组表达载体pEGFPmfn2的构建与鉴定

1为阴性对照,2为重组表达载体pEGFPmfn2阳性菌落直接PCR显示存在2.2 kb的特异性条带,3为HindⅢ和BamHⅠ双酶切得到2.2kb目的条带和4.7 kb的pEGFP-N1载体,4为HindⅢ单酶切得到的6.9 kb的重组载体,5为重组质粒未经酶切的电泳图,提示重组表达载体pEGFPmfn2获成功构建(图5)。

图5 重组真核表达载体pEGFPmfn2的鉴定

2.6 质粒测序结果

取pEGFPmfn2质粒送上海生工生物工程公司测序,所得结果与genebank报道的4.1 kb大鼠mfn2 mRNA的cDNA序列(NM-130894)的cds(166,2439)区域的序列相同,最终证明mfn2基因已被成功插入pEGFP-N1载体中。

3 讨论

Mfn2基因位于大鼠的染色体5q36,其全长cDNA序列为 4 161 bp,收录至GenBank(编号NM-130894),其开放读码框编码含757个氨基酸的线粒体膜蛋白,参与线粒体的融合,调节和维持线粒体的形态和功能[2]。目前大量研究显示该基因与多种疾病的发生密切相关[3-6],已有研究显示Mfn2的表达与VSMC的增殖密切相关,在增殖的VSMC中Mfn2的表达量下降。最新报道mfn2生理学上的重要性提示在线粒体的新陈代谢、凋亡和细胞信号起着重要作用[7],并发现该基因可以经由抑制 Ras-Raf-MEK-MAPK通路,抑制细胞的增殖[8]。

Mfn2基因通过载体导入后表达是目前研究Mfn2抑制细胞增殖作用的主要策略,而转染导入是最为常用且稳定高效的研究方法。我们设计特异性引物通过RT-PCR克隆了Mfn2基因的编码序列(2 274 bp),并与载体pGEM-T连接构建了重组克隆载体,完成了Mfn2基因鉴定和大量制备的目的。氨苄青霉素和α-筛选、HindⅢ和BamHⅠ限制性双酶切和序列分析等方法证实了Mfn2基因的存在和序列正确。载体选择方面,目前腺病毒在Mfn2基因介导中最为常用,但因转染腺病毒存在的潜在风险是今后研究,尤其是将来可能的临床研究所必须正视的。为避免这一问题,我们采用了真核表达载体pEGFPN1,其原因在于其不存在相应风险 ,同时以其为载体构建的重组载体可在E.coli和哺乳动物细胞中稳定高效表达,且可采用卡那霉素进行筛选。这样,既可利用E.coliDH5α的高效复制特性获得大量重组载体,也为下一步成功转染血管平滑肌细胞后的筛选提供技术保障。此外,pEGFP-N1是一种穿梭质粒载体,其5’端连接有增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因,外源基因可插入到质粒载体多克隆位点,最终的表达产物为目的基因所表达蛋白与荧光蛋白的融合体。我们将Mfn2基因克隆进多克隆位点,并且与EGFP在同一阅读框,使其和N端的EGFP融合表达。同时由于EGFP性质稳定,通常不影响目的基因表达产物的生物学活性,因而可以根据EGFP融合蛋白的绿色荧光的分布来分析目的蛋白在细胞中的分布和定位[9]。

VSMC正常位于动脉中层,是动脉硬化斑块和内膜增生的主要细胞类型。VSMC增殖是高血压等心血管疾病的一种显著病理特征。VSMC的增殖和迁移与动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄、冠状动脉搭桥术后桥血管闭塞密切相关。而Mfn2基因是新发现的一种增殖抑制基因,因此我们设想通过与载体pEGFP-N1构建真核表达载体,通过转基因技术研究Mfn2对VSMC的增殖抑制作用。

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