预防性MPT64和ESAT6疫苗保护力的评价

王金河,孙海林,李洪敏,吴雪琼,梁建琴,冯士生,孙 静

(1.解放军第309医院结研所结核二科,北京100091;2.鄂尔多斯二院结核科;3.朝阳区疾病预防控制中心,吉林长春130021)

当前,结核病在世界范围内疫情回升,迄今仍然是危害人类健康的主要传染病。结核病已成为传染病中的第一号杀手和最大的死亡病因之一。为探索结核病控制的新途径,利用BACTEC MGIT 960仪器分析动物实验模型主要脏器的结核分枝杆菌(MT)生长情况,观察MT的MPT64、ESAT6质粒DNA疫苗预防结核病的效力。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 BALB/C小鼠由北京药检所动物中心提供。

1.1.2MT强毒株(H37RV)由中国药品生物制品鉴定所提供。

1.1.3质粒 JW4303-MPT64和JW4303-ESAT 6重组表达质粒、宿主菌大肠杆菌DH5a由本院研究室提供,卡介苗由成都生物制品研究所提供。

1.2BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪及其相关试剂由美国BD提供。

1.3方法

1.3.1实验分组 6～8周龄雌性的 BALB/C小鼠38只,购于北京药检所动物中心,分为五组。A组6只,双侧胫前肌各注射生理盐水0.1 ml;B组6只,缓慢注射50 μ g/50 μ l载体质粒;C 组6只,注射卡介苗 0.1 ml;D 组 10 只 ,缓慢注射 50 μ g/50 μ l重组质粒JW4303-MPT64 DNA;E组10只,注射重组质粒JW4303-ESAT6 DNA(方法同D组)除C组外,其他四组分别于0、3、6周各免疫3次。

1.3.2H37RV MT强毒株(5X106 CFU/ML)攻击小鼠。在9周时每只注射0.5 ml于小鼠腹腔内。攻击一个月后,将每组前3只小鼠杀死。用75%乙醇浸泡小鼠20分钟,开腹取出肺、肝、脾。用无菌生理盐水冲洗,然后放入组织研磨器内研磨。取研磨好的组织悬液0.1 ml加入到0.9 ml生理盐水中混匀,取0.5 ml接种于BACTEC MGIT 7H9培养管中,加入0.8 ml添加剂,放入BACTEC MGIT 960培养仪内进行培养。各组剩余的小鼠被攻击两个月后,将其全部杀死,重复上述操作步骤,用BACTEC MGIT 960培养仪进行培养。每日观察培养结果,若为阴性结果需培养42天。

1.3.3淋巴细胞转化试验 取小鼠脾研磨好的组织悬液,加入淋巴细胞分离液,离心后,吸取淋巴细胞层,与适度PHA混合,置37℃培养72小时。取培养的淋巴细胞进行涂片、染色、镜检。根据细胞大小、核与胞质的比例、胞质的染色性质和核结构以及有无核仁等情况,分别计数转化细胞(包栝大淋巴细胞、过渡型母细胞、核丝分裂相细胞)和小淋巴细胞,以百分率报之。

1.3.4统计学方法 在进行淋巴细胞转化试验时,采用对比试验的统计试验方法。采用的统计量为

其中n1.表示A组的观察细胞数。n11表示转化的细胞数,n12表示未转化的细胞数。n2.表示C组的细胞观察数。n21表示细胞转化数,n22表示未转化数.K的分布近似地遵从分布。

2 结果

MT H37RV强毒株攻击一个月的小鼠肺、脾、肝培养结果,样本最快检出时间为6天,90%阳性样本检出时间为7-13天,最迟检出时间为40天,41-42天均无阳性样本检出。小鼠肺、脾、肝用BACTEC—960培养的每天GI(生长指数)平均值分别见图1。A、B、C、D、E组的淋巴细胞转化率(%)平均值分别为 54.2%;52.7%;53.8%;60.5%;56.3%。其中D、E组转化率明显高于B组。攻击二个月的小鼠肺、脾、肝的培养结果,样本最快检出时间为5天,90%阳性样本检出时间为10-15天,最迟检出时间为30天,31-42天均无阳性样本检出。小鼠肺、脾、肝用BACTEC 960培养的每天GI平均值分别见图2。A、B、C、D、E组的淋巴细胞转化率(%)平均值分别为46%;46.6%;54%;63%;59.83%。其中C、D、E组明显高于B。

一、二个月生长指数(GI)值的比较(见图3)其中,肺和肝数值明显降低,差异显箸(P＜0.05)。小鼠脾的数值无明显变化。

在淋巴细胞转化率(%)试验中,第二个月的淋巴细胞转化率平均值明显高于第一个月(见表1),以D组为最高。

图1 一个月MT生长指数

图2 二个月MT生长指数

图3 MT攻击小鼠一,二月肺的比较

表1 各组淋巴细胞转化试验对比

3 讨论

国际研究已证明了结核病的DNA免疫可表达和传递蛋白抗原,诱导机体产生细胞和体液免疫应答,对分枝杆菌产生保护性免疫[2、3、4],而国内尚无报导。为探索结核病控制的新途径,利用BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪进行动物实验模型分析[1],以观察MT的MPT64、ESAT6质粒DNA疫苗的保护效力。

分枝杆菌的抗原既有共同抗原又有种的特异性抗原,其抗原总数多达100种以上。保护性抗原是种特异性抗原的决定簇,还是共同抗原的决定簇,或者二者兼备尚在研究中。在MT的免疫应答中,哪一种抗原占主导地位、起主要作用就必须借助动物试验进行细致的研究。DNA疫苗的作用原理是使外源基因在真核细胞内表达,表达的蛋白抗原和MHCⅠ类分子结合后,被送到细胞表面,再被CD8+T淋巴细胞的受体识别而诱发CTL的细胞毒反应,这对细胞内寄生的分枝杆菌有很大的杀伤作用。MPT64、ESAT6质粒DNA都是分枝杆菌复合群主要的分泌性蛋白质,也是其重要的T细胞抗原。本研究将上述二种DNA疫苗免疫小鼠,借以观察小鼠的体液免疫和细胞免疫应答,并通过试验评价这二种DNA疫苗的保护作用。

利用BACTEC 960全自动分枝杆菌培养仪进行动物试验模型主要脏器的MT生长情况,研究资料显示上述二种DNA疫苗在小动物试验的预防过程中是有效力的(见表1)。DNA组细菌计数下降率比载体对照组(B)明显。第二个月比第一个月培养时间明显向后推迟且集中。同时,第二个月曲峰强度也比第一个月明显减弱,可能说明小鼠经DNA疫苗刺激后,免疫力增强,使MT生长受抑制和生长速度减慢的原故。据Kamath报道[2]用呼吸道气雾攻击小鼠4周时,MPT64DNA疫苗可使肺部MT菌落数比载体对照减少0.38log10,与本试验相同,但试验中也反应出小鼠个体生长指数差异明显,从各组间分析,除A组之外,其它各组小鼠肺和肝GI值均有不同程度的下降,以D组最明显,淋巴细胞转化率也证明了这一点。说明D组的重组质粒JW4303-MPT64保护力优于E组ESAT6质粒DNA疫苗的保护效力。C组卡介苗第一个月预防效力比第二个月强,证明卡介苗保护效力好,但随时间的延长,此作用开始减弱。小鼠脾的计数无规律,可能与之对MT不敏感有关。总之,与B组比,小鼠免疫力的短期预防是有所增强,其中卡介苗前期效果明显;MPT64、ESAT6是持续效果好。

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[2]Brandt L,Feino Cunha J,Weinreich Olsen A,et al.Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine:some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis[J].Infect Immun,2002,70:672.

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[6]Pym AS,Brodin P,Brosch R,et al.Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccinesMycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti[J].Mol Microbiol,2002,46:709.