亚砷酸钠对血管增殖效应的体内体外研究

董 雪,史艳芬,吕 慧,范洪学,李荣贵*

(1.吉林大学病理生物学教育部重点实验室,吉林长春130021;2.吉林大学公共卫生学院;3.长春中医药大学)

饮水型地砷病是由于长期摄入过量砷而引起的一种慢性蓄积性中毒性疾病,在世界范围内广范存在,已成为严重威胁人类健康的公害病,其中大部分分布在亚洲国家,中国正是受砷中毒危害最为严重的国家之一[1,2]。亚砷酸钠是饮水型地砷病中砷化物存在的主要形式,其常见临床表现以肢端中小血管循环障碍及皮肤损伤为主,严重的患者甚至会引起恶性肿瘤[3]。病理上以末梢血管退行性变及肢端坏死为主要改变。饮水型地砷病目前引起血管损伤的机制不清,本研究拟用鸡胚绒毛尿囊膜血管新生模型和人脐静脉血管内皮细胞作为实验对象,研究砷对血管增殖效应的体内体外作用,以期为地砷病的血管损伤机制提供理论基础。

1 实验材料、仪器

亚砷酸钠(NaAsO2),购于SIGMA公司;HUV-EC(人脐静脉内皮细胞)由吉林大学第一医院中心实验室惠赠,(Dulbecco’s Modified Eagle Media,DMEM)培养基购自Gibco公司;优级胎牛血清购自北京元亨金马生物公司;LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司;Trizol试剂盒、RT2PCR试剂盒购自Takara公司;2×SYBR GreenⅠ试剂购自ABI公司。Real time2PCR仪为美国ABI7300。受精种蛋购于龙德养鸡场,每只55-65 g。

2 方法

2.1CAM模型的建立

CAM造模参考文献方法[4]进行改良。鸡胚 50只,在37℃、5%CO2及50%的相对湿度下孵化。

2.2向CAM加药

用打孔机将玻璃纤维滤纸制成直径3 mm的小圆片,湿热灭菌。 设 6 个给药组(0.033、0.33、3.3、0.1、1、10 μ mol/L)并设PBS阴性对照组。鸡胚孵化3天后照蛋检查血管网生长情况,剔除未发育的种蛋,每组5只。在超净台内,将种蛋表面用酒精消毒后,用镊子在蛋胚顶端小心戳一小口,然后剥去周围的蛋壳和壳膜,使开口约为1.5 cm×1.5 cm大小。小心地用尖手术镊子从气室与卵黄囊分隔处挑破气室膜,轻轻去除上层气室薄膜,暴露下层的CAM 膜。将吸附10μ l药物或等量PBS的载样滤纸置于CAM和卵黄囊膜处血管较少的部位,然后用灭菌透明胶封口,继续孵育24 h。观察,计数药膜周围5 mm内血管数,并摄影记录。

2.3细胞培养HUV-EC培养在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,置于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养。

2.4HUV-EC增殖的检测取指数生长期细胞,以5×103个细胞/孔接种于96孔板,100μ l/孔,加入不同浓度亚砷酸钠(如图2所示),作用 24小时后,每孔加入 CCK-8液10 μ l,置于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱继续培养1小时,室温下低速振荡5 min,静置10分钟,酶标仪450 nm处测定吸光度,重复3次,计算抑制率。

2.5总RNA提取及RT-PCR分别按照产品说明书,应用Trizol试剂提取细胞总RNA。应用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA(具体操作步骤均按厂家产品说明书进行),其反应条 件为:30℃、10 min,42℃、30 min,99℃、5 min,5℃、5 min。c-myc、c-jun采用实时定量 RT-PCR(SYBR Green法)进行。反应程序为:50℃2分钟;95℃10分钟;92℃10秒,60℃30秒,共50个循环。引物由上海生工生物工程公司合成,引物序列见表1所示。

表1 实时PCR引物序列

2.6统计学处理所有数据采用SPSS10.0软件进行统计学分析,结果用均数±标准差(s)表示,P＜0.05有显著差异,有统计学意义。

3 结果

3.1NaAsO2对CAM血管生长的影响在低于1 μ mol/L浓度范围内,肉眼观察可见随亚砷酸钠浓度增加,与对照组(0 μ mol/L)相比给药组载体下,血管明显生长,可见尿囊膜血管排列成车辐状,类似树叶的叶脉状分布,在 0.33 μ umol/L时即有统计学意义(P＜0.05)(如图 B所示);在高于1 μ mol/L浓度范围内。随着亚砷酸钠浓度增加,血管结构破坏,或血管虽有一定数量,但其结构并未形成熟血管的圆形状态,在部分给药载体旁,没有血管区域,当浓度达到10μ mol/L(如图E所示),给药载体旁形成血管池,鸡胚的发育明显抑制,部分鸡胚死亡,与对照组相比有明显的统计学差异(P＜0.01)。

图1 亚砷酸钠对CAM的作用

表2 不同浓度NaAsO2对CAM血管生长的影响

3.2NaAsO2对HUV-EC增殖的抑制作用HUV-EC经过不同浓度的亚砷酸钠溶液孵育24小时后,用CCK-8试剂盒检测活细胞数,分析亚砷酸钠对细胞抑制的影响。结果显示:亚砷酸钠对HUV-EC作用24 h时,30、40 μ mol/L实验组细胞数与0 μ mol/L对照组相比有差异性(P＜0.05);50 μ mol/L以上的实验组细胞数与相应对照组相比均有显著性差异(P＜0.01);其对细胞增殖的抑制率随亚砷酸钠浓度的增加而增大,有剂量-效应关系如图2所示。

图2 亚砷酸钠对HUV-EC的抑制作用

3.3NaAsO2降低HUV-EC的c-myc、c-junmRNA 应用实时定量RT-PCR技术对HUV-ECmRNA表达水平的分析,结果显示:经20μ mol/L浓度亚砷酸钠处理的HUV-EC,其 c-myc、c-jun的mRNA表达水平明显降低。结果如图3所示:经过20 μ mol/L亚砷酸钠溶液处理后,HUVECs的增殖基因mRNA表达量与对照组细胞相比分别下降了69%和19%,统计学上均有显著性差异(**P＜0.01)。

图3 亚砷酸钠降低HUV-EC的c-myc、c-jun mRNA水平

4 讨论

地砷病的发病机制目前并不十分清楚,在其疾病的发生发展过程中,常见以末梢血管退行性变及肢端坏死为主要改变。鸡胚尿囊膜(CAM)血管新生模型是常用的体内血管研究模型。在Nicole V.Soucy等人研究基础上[5],本研究进一步验证了3.3μ mol/L浓度的亚砷酸钠对血管即有明显的抑制作用(P＜0.05),当浓度达到 10 μ mol/L时,给药载体周围已形成血管池,部分鸡胚甚至死亡。本研究中又以HUV-EC为体外研究模型,研究砷对其作用。我们在较早的研究中就发现亚砷酸钠可以通过线粒体途径诱导血管内皮细胞凋亡,这在其对血管损伤进程中发挥关键作用[6]。本实验结果显示亚砷酸钠在30 μ mol/L时,就明显抑制HUV-EC的增殖,在所用的亚砷酸钠浓度范围内呈典型的剂量-效应关系。

c-myc、c-jun是一种转录调控蛋白,它与其蛋白配基(主要是Max蛋白)形成复合物后转移并定位于胞核内,与DNA特异性的序列相结合,参与调节Cyclin、CDKs等细胞周期关键蛋白的表达[7],进而影响细胞生长、增殖、分化和细胞周期。提示本实验结果:亚砷酸钠抑制血管内皮细胞的增殖,是通过下调c-myc[8]、c-jun基因的表达,进而降低细胞周期相关蛋白的含量,影响细胞周期实现的。

随着亚砷酸钠浓度增加,CAM血管增生明显受到抑制,HUV-EC增殖抑制率明显升高,且 c-myc、c-jun基因表达量下降,说明砷化物是通过下调c-myc、c-jun表达来抑制血管增殖。在饮水型地砷病中内皮细胞的增殖在维持血管完整性、血管损伤的修复过程中起到重要作用,而本研究结果发现亚砷酸钠对体内血管及体外HUV-EC增殖均有抑制作用,从而提示:在地砷病的发病过程中,NaAsO2对血管增殖抑制是其致病机制之一。

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[8]吕 慧,史艳芬,等.亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞迁移、增殖的影响及其机制研究[J].江苏医药杂志,2010,待发.