小鼠腹腔异位心脏移植模型的建立及移植心功能监测

王远涛,胡 钰,王 钢,高宝山,栾秀华,曹彦明,王金国*

(1.吉林大学白求恩第一医院泌尿系统疾病诊治中心,吉林长春130021;2.吉林大学中日联谊医院病理科)

目前国内外对于大鼠心脏移植模型的制作已较为成熟,而小鼠与大鼠相比具有更多优点,如遗传背景清晰,成本低廉等,其腹部心脏移植模型正被越来越被广泛的应用于器官移植免疫的研究[1]。但由于小鼠个体小、血管细、手术耐受性差,手术难度高于大鼠。本实验借鉴国内外报道的手术方式,并加以改良,成功的建立了小鼠腹部异位心脏移植模型,提高了手术成功率,降低了操作难度。并可通过腹部移植心触诊,监测移植心功能,操作简便准确。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及分组 选取雌性C57BL/6小鼠180只,BALB/C小鼠60只,约6-8周龄,体重15-20 g,购于吉林大学第一医院动物实验中心。同系同基因组:C57BL/6小鼠120只,分别作为供、受体;同系异基因组:BALB/C小鼠 60只作为供体,C57BL/C小鼠60只作受体。供、受体体重差异无显著性,手术前后不禁饮食。

1.1.2手术器械及试剂 单人双目手术显微镜一台购于深圳瑞沃德公司;显微手术器械购于德国Roboz公司;10-0带线缝合针购于美国Ethicon;5-0及6-0医用丝线上海医用缝合厂;水合氯醛及肝素由吉林大学基础医学院提供。

1.2 手术方法

1.2.1供体手术 麻醉采用腹腔注射4%水合氯醛(10 μ l/g)的方法。供体小鼠麻醉满意后,四肢用胶带固定于自制鼠板上。腹部剃毛后、酒精消毒后迅速沿正中切口进入腹腔,显露下腔静脉,经下腔静脉静推注1%的肝素盐水0.3 mL,使供体小鼠全身肝素化。约1 min后,剪断腹主动脉放血,并迅速剪开膈肌,沿胸骨中线剪开胸骨至颈部,自制胸腔拉钩牵拉两侧肋骨,剥离胸腺组织,充分暴露心脏并迅速喷洒冰盐水降温。迅速结扎下腔静脉,于右肺门靠近心脏处6-0丝线集束结扎,剪除右肺。充分游离肺动脉至分叉处横断;充分游离主动脉,并于主动脉弓头臂干分支远侧30G细针穿刺,以10 ml冰盐水灌洗心脏至颜色苍白为止,并于头臂干分支近侧将其横断。其余血管及组织于近心脏侧集束结扎并切断。取下供心,置于4℃生理盐水中保存备用。

1.2.2受体手术 将小鼠用上法麻醉满意后,固定于鼠板上。腹部剃毛、消毒后,经正中切口单层进腹;切口上至剑突,下至耻骨上膀胱区。腹壁切口两侧采用自制拉钩牵拉固定。剪开小肠与直肠间的系膜,将肠管向右上腹推移,充分显露下腔静脉及腹主动脉,上至肾动静脉水平,下至髂血管水平,并以湿盐水纱布包裹,保护肠管。用棉签充分游离下腔静脉及腹主动脉周围结缔组织,电灼器烧断细小血管分支,清除腹腔及髂血管处淋巴结。血管夹同时阻断下腔静脉及腹主动脉,用30G针头于腹主动脉戳一小孔,然后沿孔作一纵行切口,行供心主动脉和受体腹主动脉端侧吻合。吻合方法为:将供心以冰盐水纱布覆盖并置于小鼠右侧腹腔,10-0血管吻合线于吻合口两端各作一牵引线,自头侧一针连续缝合至尾侧打结固定后,翻转心脏至左侧,行后壁连续缝合,与头侧牵引线打结固定。同法剪开下腔静脉,行肺动脉和下腔静脉端侧吻合,吻合方法为:将供心翻于腹腔左侧,于吻合口两端各作一牵引线,自尾侧一针连续缝合至头侧打结固定后,翻转心脏至右侧,头侧牵引线穿过供心主动脉与肺动脉间隙后,连续缝合至尾侧打结固定。吻合完毕后,缓慢打开血管夹,同时检查吻合口有无渗血,棉签压迫静脉吻合口处10秒,待右心室充盈后松开棉签。棉签轻触心脏,促其复跳。观察移植心复跳有力后,将肠管复位后,单层连续缝合关闭腹腔。灯下保温至小鼠苏醒。术后不限食水。

1.2.3移植心功能监测 为避免出血,术后3天内不行腹部移植心触诊;3天后开始每天行腹部移植心触诊,心功能根据移植心跳动由强到弱分为4-0级,每天记录。以指尖不能触及移植心跳动记为0级,并作为移植心排斥的时间点。所有0级心脏移植物均需剖腹探查证实移植心停跳,并取下移植心行病理学检查。以术后100天作为实验终点,所有心脏移植物均行病理学检查。

2 结果

共行手术120例,手术成功110例并长期存活,4例术中出现吻合口出血,2例术后移植心内出现血栓,2例术后复跳不佳,1例出现动脉血栓至下肢瘫痪,1例出现麻醉意外,手术成功率91.67%(110/120)。供体手术时间(13.4±1.1)min,受体手术时间(40.2±2.8)min,其中吻合时间(25.6±2.5)min。

同系同基因组:手术成功56例,术后100天内经腹部移植心触诊,移植心跳规律,搏动有力,心功能分级均保持在4-3级,MST＞100天;同系异基因组:手术成功54例,通过移植心触诊,多数移植心从术后5天开始出现不同程度的心律减慢、心律不齐、搏动减弱,移植心体积变大等表现,心功能等级由4级开始明显降低;绝大多数移植心功能分级于术后7天降至0级,表现为移植心触诊不能触及任何搏动,移植心体积明显增大,质地硬,移植心MST=7天。

心脏移植物行H&E染色,观察移植心内炎性细胞浸润情况。同系异基因组心脏移植物内可见大量炎性细胞浸润,且毛细血管内膜显著增厚,管腔堵塞(图1 A);同系同基因组移植心内,未见明确炎性细胞浸润,毛细血管内膜正常,管腔通常(图1 B)。

图1 移植心H&E染色结果

3 讨论

以往心脏移植模型中较多应用的是小鼠颈部心脏移植[2,3],由于颈部空间相对较小,操作难度大,且需使用套管,对血流影响大,移植心触诊范围小,这些都可以对实验结果造成影响。因此,目前国外大多推荐采用腹部异位移植模型[4-5]。现将笔者等执行本实验的实践经验讨论如下。

3.1 供心切取

整个过程最好要控制在15 min之内,这样有利于供心质量的控制。需仔细分离升主动脉与肺动脉之间的韧带,以免吻合时相互牵拉,影响手术进度。应尽可能保留较长的主动脉及肺动脉,以便吻合。集束结扎右肺门时,应注保护右心耳根部窦房结,以免影响心脏复跳。集束结心脏背侧血管时,切忌损伤左右心耳,否则也易造成术后出血不止。供心切取过程中,需主动脉弓穿刺冰盐水灌洗,可更好的保护心肌功能,防止血栓形成。

3.2 受体手术

由于腹主动脉和下腔静脉紧密相连,因此不必强求分开,但血管周围脂肪及大的淋巴结必须剔除干净,以免影响吻合。受体的腰部分支血管需用电灼器烧断,以免分离过程中撕破血管引起大出血。动脉吻合过程中要特别注意两角的吻合,为防止漏血可贴近两角固定线处缝合第一针,动脉吻合时每边4-5针即可,避免缝合过密或收线太紧引起吻合口狭窄。由于静脉壁很薄,应注意辨认前后壁,静脉吻合时需轻柔,静脉吻合时收线不宜过紧,每边5-6针即可,最终打结时宜松不宜紧。开放血运后,对于吻合口少量渗血,可用棉签压迫片刻,效果较好。

3.3 围手术期的其他处理

整个手术过程中,术野移植心、肠管等处均需盐水纱布覆盖,并不时滴加冰盐水,以保护组织。术后小鼠应处于温暖环境,促进其苏醒。

3.4 移植心功能监测

通过腹部移植心触诊监测移植心功能,腹部操作空间大,干扰因素小,术者可每天进行触诊,连贯记录移植心跳动情况。心功能0级的移植心经病理证实,均出现不同程度的排斥反应,而心功能4-3级的移植心未见明显炎性细胞浸润。说明通过腹部移植心触诊的方法监测移植心功能,是一种准确且有效的方法。

[1]Ono K,Lindsey ES.Imp roved technique of heart transplantation inRats[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1969,57(2):225.

[2]Chen HA.New technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice[J].Transplantation,1991,52(6):1099.

[3]Steinbruchel DA,Nielsen B,Salomon S,et al.A new model forheterotopic heart transplantation in rodents[J].Transplantation Proceedings,1994,(26):1298.

[4]Demir Y,Chen Y,Metz C,et al.Cardiac allograft rejection in the absence of macrophage migration inhibitory factor[J].Transplantation,2003,76(1):244.

[5]Chen Y,Demir Y,Valujskikh A,et al.Antigen location contributes to the pathological features of a transplanted heart graft[J].Am J Pathol,2004,164(4):1407.