HPV58型衣壳蛋白L1和L2基因的克隆表达及病毒样颗粒的装配

王丽娜,陈 伟,甘义明,刘艳丰

(1.吉林大学第一医院妇产科,吉林 长春130021;2.吉林大学中日联谊医院骨科,吉林长春 130031;3.吉林大学附属医院放射线科,吉林 长春130021)

目前研究已经证实高危型人乳头瘤病毒的感染是宫颈癌的病因,宫颈癌组织中99%可检测到HPV。现已经发现的HPV大约200余型,根据地域的不同,各型的发病率也不同。在全世界范围内以16型最常见,在我国和一些亚洲和非洲国家,58型居于第二位[1,2]。鉴于我国58型HPV的高发的情况,我们开展了HPV58相关宫颈癌疫苗的基础研究工作,应用真核细胞大量表达并纯化了HPV衣壳蛋白(L1L2蛋白),组装成病毒相似颗粒,并对其免疫原性进行研究。

1 材料和方法

1.1 试剂及标本的来源

pUC19-HPV58(含全长的 HPV58基因)、由日本国立感染症研究所神田惠赠。pGEM-T easy质粒购自Promega公司。PCR试剂盒、限制性核酸内切酶 NotI、KpnI、XhoI购自TAKAR A公司。连接酶、BAP75、HPV16L1抗体购自 Pharmingen公司,羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶、福氏佐剂、pFastBac-1、pFastBac Duel质粒,转染用试剂 Effectene购自QIAGEN公司。引物由日立计测器服务株氏会社订制。DH10Bac菌株、Sf9细胞及培养液SFII900、兔抗 hpv L2多肽抗体(108-120aa)购自GIBCO Invitrogen corporation公司

1.2 PCR扩增58L1,58L2片段克隆测序

以pUC19-HPV58为模板,L1的上游引物 5’-ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGT,下游引 物 3’-TTATTTTTTAACCTTTTTGCG。L2的上游引物 5’-CTCGAGATG AGACAAACGGTCTACA,下游引物 3’-GGTACCCTAGGCCGCCACACGGACATC。PCR 反应体系:模板 100 ng,ExTaq0.25,引 物各 0.5 mM,dNTP5 μ l,10 ×Buffer 5μ l,加蒸馏水至 50μ l。反应条件:94℃ 3min,进入循环94℃30 s,55℃30 s,72℃2 min,循环25次,72℃延伸7 min。反应产物8%琼脂糖凝胶电泳后回收L1的1574bp片段和L2的1 418 bp片段,过柱纯化后,连接入pGEM T easy质粒构建成pGEM T easy-58L1和pGEM T easy-58L2质粒,并转入DH5α大肠杆菌中扩增,提取质粒用Genetic Analyzer 310测序仪(ABI PRISM公司)测序。挑取正确的克隆扩增DNA进行下一步实验。

1.3 构建pFast Bac-1-58L1和pFast Bac duel-58L1L2

1.3.1pFast Bac-1-58L1的构建 将pFast Bac-1用NotⅠ酶切后,末端去磷酸化。pGEM T easy-58L1NotI酶切后接入pFast Bac-1中构建成pFast Bac-1-58L1重组质粒。PvuII和HindⅢ双酶切筛选方向正确插入的重组质粒。

1.3.2pFast Bac duel-58L1L2构建 pFast Bac duel质粒和pGEM T easy-58L2分别用KpnI和XhoⅠ双酶切后,pFast Bac duel载体侧去磷酸化,插入KpnI-58L2-XhoⅠ片段。酶切筛选正确插入片段的重组质粒pFast Bac duel-58L2,此质粒用NotI酶切去磷酸化后插入58L1片段,同样酶切鉴定插入方向。构建成pFast Bac duel-58L1L2重组质粒。

1.4 重组杆状病毒载体的构建

pFast Bac-1-58L1和 pFast Bac duel-58L1L2分别转导入DH10Bac大肠杆菌中,使其与大肠杆菌中的杆状病毒DNA(Bacmid)发生同源重组。PCR鉴定筛选发生同源重组的杆状病毒载体Bacmid-58L1,Bacmid-58L1L2。

1.5 昆虫细胞的转染和病毒液的制备

各10 ng的Bacmid-58L1,Bacmid-58L1L2转染 sf9昆虫细胞,转染方法按试剂盒所示操作。27C培养三日后回收上清液,即病毒液P1,再以P1感染sf9制备病毒液P2。

1.6 HPV58L1和HPV58L1L2蛋白的大量表达纯化及检测

用病毒液P2感染sf9细胞。27℃孵育3日后回收细胞,3 000 rpm离心5 min。沉淀细胞PBS缓冲液洗涤2次,加5%NP-40的PBS重旋细胞后置冰中10 min。4℃,5 000 rpm离心30 min。弃上清,沉淀细胞核加1.28 g/ml的CsCl-PBS,超声破碎。31 000 rpm,20℃,离心24 h。96孔板分段收集离心后的液体。各取 1 μ l上样于10%SDS-PAGE胶,电泳后进行考马斯亮兰染色和western blot。选取L蛋白浓度最高处的收集液,在PBS缓冲液中透析过夜。5/45%的蔗糖密度梯度离心,35 000 rpm4C,2.5 h。96孔板分段收集。再次SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色,鉴定蛋白是否纯化。Westernblot一抗为用小鼠制备的hpv16L1单抗,1∶5 000稀释。

1.7 电镜观察纯化后的两种蛋白是否形成病毒相似颗粒

1.8 制备抗体

取纯化的蛋白L1,L1L2。各75 μ g与等体积的佐剂混匀后,生理盐水稀释至250 μ l,6周龄的 Balb/C小鼠背部皮下注射,一周后加强免疫一次。五周后再次加强注射一次,加强免疫剂量减半,方法同前。首次免疫后六周处死小鼠,腹主静脉取血。离心制成抗血清。

1.9 血清中抗体的检测

取纯化的58L1L2蛋白,及纯化后的16L1L2共表达的蛋白(近藤博士赠送)进行SDS-PAGE电泳,以上述制备的抗血清(1∶2 000稀释)为一抗进行 Western blot分析,按照 ELC试剂盒操作,STOM显影。

2 结果

2.1 HPV58衣壳蛋白与杆状病毒重组并在昆虫细胞中高效表达

将感染58L1和L1L2重组杆状病毒的SF9细胞破坏细胞核后进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色均在55 kD处出现明显的蛋白条带,与L1蛋白大小一致。但在70KD处(相当于 L2蛋白大小)无明显条带出现(结果未附)。以HPV58L1抗体为一抗的Western-blot结果显示两种重组病毒感染的细胞均在55KD处出现特异性条带(图1A)。而阴性对照组(空载体Bacmid感染的Sf9细胞)无此蛋白表达。另外,以HPVL2抗体为一抗的Western-blot结果显示 Bacmid-L1L2感染的细胞在70 kD处出现特异性条带(图1B)。

图1 重组杆状病毒感染的Sf9细胞Western-blot分析

2.2 单独表达的58型L1及共表达的L1L2蛋白均能自主组装成病毒相似颗粒

两种纯化的蛋白透析后,分别以PBS稀释后电镜下观察病毒颗粒形成情况。单独表达的L1蛋白及L1L2共表达的蛋白均能形成病毒相似颗粒,大小和形态与野生型的病毒颗粒难以分辨。如图2所示。

2.3 用小鼠制备的抗血清中抗体的分析

纯化后的HPV58L1-VLP、HPV58L1L2-VLP进行SDS-PAGE电泳,用纯化后的VLP免疫小鼠所获得的抗血清HPV58L1 Mb、HPV58L1L2-Mb做一抗进行 western-blot分析,结果如图3A、3B所示,两组血清做一抗的电泳均可在55 kD处出现特异性强杂交信号,相当于L1蛋白大小。而HPV58L1L2-Mb做一抗的结果中HPV58L1L2-VLP电泳在70kD处(相当于L2蛋白大小)未出现期望的条带。

图3 以免疫小鼠制备的抗血清为一抗的Western-blot

3 讨论

宫颈癌占女性恶性肿瘤的12%,成为世界范围的第二位的妇科肿瘤[3]。其中接近80%的病例发生在发展中国家。人们已经认识到HPV感染是宫颈癌的首要病因,因此针对HPV感染的宫颈癌疫苗的研制成为国内外学者研究的焦点。国外学者研究表明单独表达的 hpv16L1或共表达的hpv16L1L2自主组装成的VLP具有与野生病毒相同的抗原表位,以此免疫小鼠,产生的抗体具有中和活性,能抑制HPV的感染。而且这种VLP只是空的蛋白衣壳,不含病毒的原癌基因,不会人为的导致癌变,安全有效,是很有前景的宫颈癌的预防疫苗。在美国上市的HPV预防性疫苗是GSK公司开发的16/18二价疫苗,和Merck公司开发的6/11/18/16四价疫苗,临床研究证实注射后产生的抗体效价比自然感染后产生的抗体效价高50倍。HPV16单价的疫苗对3,4年内宫颈上皮内瘤样病变的发生起到100%的保护[4]。采用16/18双价疫苗对4,5年内宫颈上皮内瘤样病变的发生起到100%的保护[5]。

目前已经发现的HPV病毒有200余亚型,与宫颈癌密切相关的高危型也有18种,迄今还没有一种疫苗能够抵抗所有型别的HPV感染。在我国和一些亚洲国家58亚型的感染是仅此于16亚型的,为开发适合于我国妇女的宫颈癌疫苗,我们对HPV58进行了细致的研究,应用杆状病毒昆虫表达系统进行了hpv58型衣壳蛋白L1单独表达以及L1L2的共表达。结果证明了其与hpv16型相同,大量表达纯化的58型hpvL1蛋白能单独自主组装成VLPs。与L2共表达的L1蛋白亦自主组装成VLPs。电镜下其形态与野生型hpv完全相同。这种hpv58特异的VLPs的制备,对于我国宫颈癌的预防性疫苗的开发具有重要的意义。

此实验中应用的目的基因片段-58L1序列是从L1的第二个ATG开始的,去掉了N-末端的26个氨基酸。实验中曾应用完整的L1序列进行实验,但表达的L1蛋白量少,且很难得到纯化(结果未附)。有可能是由于hpv58L1的N末端的几个氨基酸结构特殊,与细胞中的其他蛋白结合,影响L1的纯化。实验表明去除N末端的几个氨基酸后并不影响所表达蛋白的活性。仍然具有自主装配的活性[6]。(L1抗原决定簇被中和抗体识别具有构象依赖,变性L1不会诱导中和抗体产生,因此保持野生病毒的空间构象对预防性疫苗非常关键,我们纯化后的蛋白经电镜检测证实L1单独以及L1/L2蛋白联合均能自主包装成VLPs,与野生型病毒颗粒外观一致。

文献报道野生型病毒中L1与L2的表达量为30∶1,L2蛋白的表达量虽然少,但也具备中和表位,研究表明,L2在病毒选择性包装乳头瘤病毒DNA上和增加乳头瘤病毒的传染性方面发挥作用。L2可能还有促进病毒颗粒的装配,抵消E2的转录和复制的活性[7]。而且实验证明在酸性溶液中L1/L2组装成的VLP比L1单独组装的更稳定。关于5量体的衣壳粒的具体结合方式尚未解明,但衣壳粒之间相互结合形成衣壳时,必须有2或3个二硫键[8]。

L2的108-120氨基酸是抗原决定簇,针对这个抗原决定簇的抗体具有中和活性。表达L2-GFP-组氨酸的融合蛋白与多种细胞共同孵育,随时间的推移,融合蛋白首先黏附在细胞膜表面,继之进入细胞内,由此推测L2蛋白可能在病毒感染上发挥重要作用,因此诱导针对L2的抗体也很重要,我们实验中应用的L2抗体是用兔制备的抗hpv L2多肽抗体(108-120aa),108-120多肽是L2蛋白的中和抗原决定簇所在部位,本次实验Western-blot结果显示L1L2共表达的产物在70KD处出现淡淡的条带,说明自主装配的L1L2VLP可能亦具备L2的中和表位。能增强VLP的免疫反应性。我们用所表达纯化的蛋白分别免疫小鼠后均诱导出了高滴度的L1特异性抗体,但与L1共同表达的L2没有产生相应的抗体。可能是由于L2的表达量过少,不足以产生能检测得到的抗体。今后的目标是如何能增强L2蛋白的表达量,而不影响VLP的形成。制作出能诱导L1,L2中和抗体的疫苗。

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