雷帕霉素阶梯用药方案在异基因大鼠皮瓣移植模型中的疗效观察

肖博 李扬 付苏 刘蓓 郭树忠

严重烧创伤后遗留的组织缺损较难修复，自体 组织移植后形态、功能均不佳。复合组织异体移植(composite tissue allotransplantation，CTA)是修复此类缺损的有效方式。CTA是包含多种组织类型的异基因移植。迄今，已有数十例手移植和十多例颜面移植成功应用于临床［1-4］，极大改善了患者的生活质量。然而，复合组织一般包含诸如皮肤、肌肉、神经、骨、软骨、脂肪等多种组织成分，引起的宿主免疫排斥反应复杂而强烈，需要的免疫抑制剂用量超过一般器官移植所需的量。长期、大量应用免疫抑制剂后会对受者产生诸如抵抗力下降、脏器损伤、恶性肿瘤发生率增加等副作用，对机体损伤很大。因此，寻找能够有效减少抗排斥反应药物用量的方法是CTA能否广泛应用的关键。异基因移植后排斥反应在移植后早期很强，逐渐减弱，因此术后免疫抑制剂的用量也从大到小，形成阶梯用药。雷帕霉素是一种低毒的新型免疫抑制剂，我们应用大鼠下腹部皮瓣异基因移植模型进行雷帕霉素阶梯用药疗效观察，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

雄性Lewis(RT11)和 Brown Norway(简称 BN，RT1n)近交系大鼠，8～l0周龄，体质量0.20～0.25 kg。均购自北京Vital River公司，购买后由第四军医大学实验动物研究中心专业人员负责饲养，饲养条件为清洁级。雷帕霉素原药购自华北制药厂，用生理盐水溶解制成质量浓度为1 g/L溶液－20℃保存。

1.2 模型制作及分组

以BN鼠为供体，Lewis鼠为受体，以股动、静脉为蒂进行同种异体下腹部游离皮瓣移植。采用戊巴比妥钠麻醉，剂量为50 mg/kg，腹腔注射给药，术中必要时追加1/4量。手术过程简述如下:在大鼠下腹部设计4 cm×4 cm大小皮瓣切取范围。皮瓣的切割深度在腹肌肌膜表面。分离出腹壁浅动静脉及股动静脉，而后在腹壁浅动静脉发出点远端结扎并剪断大鼠股动静脉，在大鼠腹股沟韧带外切断股动静脉，皮瓣游离完成。相同范围切除供体皮肤组织，小心解剖股动静脉。供体股动静脉和受体股动静脉采用端端吻合。动静脉吻合完成后，依层缝合肉膜和皮肤，移植手术完成。根据不同雷帕霉素用药方案分为4组:Ⅰ 组(n=5)，不使用任何药物;Ⅱ 组(n=5)，雷帕霉素 2 mg·kg－1·d－1;Ⅲ组(n=5)，雷帕霉素 4 mg·kg－1·d－1;Ⅳ组(n=8)，雷帕霉素术后1～2周 4 mg·kg－1·d－1，术后第 3 周改为2 mg·kg－1·d－1，第 4 周起 1 mg·kg－1·d－1。3 个给药组均采取腹腔注射的方式给药，用药直至皮瓣发生排斥反应坏死或至术后60 d(观察终点)。

1.3 大体观察

术后每天观察皮瓣变化，观察的排斥反应征象包括红斑、皮肤质地变硬、表皮脱屑和皮瓣发黑坏死。以皮瓣组织完全坏死记为排斥反应终点。

1.4 组织病理学检查

术后7 d对各组皮瓣组织进行皮肤活组织检查(以下简称活检)，术后15、30 d对Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组皮瓣组织进行皮肤活检，各组动物在每个时间点选取3只进行取材活检。取材方法为:给予动物半量麻醉，剪开一侧皮瓣边缘缝线，每次剪去1 cm×0.5 cm皮瓣组织，电凝止血后将皮瓣组织重新缝合于受体皮肤。所取组织用10%甲醛溶液固定，然后储存于70%的乙醇中，切片，HE染色，进行病理学检查。参考Banff 07标准［5］，对组织切片进行病理学分级。0级，没有或极少炎症细胞浸润;1级，轻微血管周围炎，表皮不受累;2级，中等程度炎症细胞浸润，有或没有表皮及皮肤附属器受累［限于棘层细胞水肿或发生胞吐(exocytosis)现象］;3级，真皮层严重的炎症细胞浸润，表皮受累包括表皮凋亡、角化不良、角质溶解(keratolysis)等;4级，坏死性急性排斥反应，表现为表皮或皮肤其他结构坏死。

1.5 统计学方法

移植皮瓣存活数据制成Kaplan-Meier生存曲线，组间比较应用对数秩检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 移植皮瓣存活情况和大体观察

各组移植皮瓣存活曲线见图1。

图1 各组移植皮瓣存活情况

Ⅳ组与Ⅱ组移植皮瓣存活率差异有统计学意义(P＜0.05)，但Ⅳ组与Ⅲ组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

Ⅰ组排斥反应进展迅速，移植皮瓣排斥反应过程表现为颜色逐渐苍白，皮瓣肿胀逐渐加重，最终因微血管血栓、阻塞至皮瓣组织发黑坏死(见图2A)。Ⅱ组给药后皮瓣无明显肿胀，颜色质地正常。术后10 d左右出现表皮脱屑，继而出现皮瓣发红，质地变硬，表皮脱落，直至皮瓣于术后16～20 d坏死(见图2B)。Ⅲ组直至术后60 d，5例受体均未出现排斥反应征象。Ⅳ组为阶梯用药组，除1例于术后30 d开始发生急性排斥反应(见图2C)，术后38 d皮瓣坏死外，其余7例直至观察终点均未出现排斥反应征象。Ⅲ组和Ⅳ组存活至观察终点的受体移植皮瓣组织变化情况为:术后皮瓣无明显肿胀过程，颜色正常，质地柔软;术后20 d左右开始，皮瓣表面毛发开始脱落，同时新的表皮组织形成;术后30 d左右，这一过程完成(见图2D)，形成新的表皮组织。术后50 d左右，新的毛发开始长出。这些结果提示，持续应用较小剂量的雷帕霉素(2 mg·kg－1·d－1)不能使移植物长期存活。当药量增加到 4 mg·kg－1·d－1后，移植物可获得长期存活。而与大剂量(4 mg·kg－1·d－1)用药方式相比，阶梯用药方式可以达到相同的抗排斥反应效果。

2.2 皮瓣组织移植病理学变化

术后7 d，Ⅰ组组织镜下可见真皮层大量单个核细胞浸润，表皮细胞稍肿胀，依据Banff 07标准，评为3级(见图2E，I);Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组皮肤组织未见异常，评为0级。术后15 d，Ⅱ组可见真皮层内中等量的单个核细胞浸润，毛囊周围炎细胞浸润，表皮未受累，评为2级(图2F，J);Ⅲ、Ⅳ组皮肤组织未见异常，评为0级。术后30 d，Ⅳ组中有1例样本组织真皮层有大量单个核细胞浸润，真皮浅层可见带状炎细胞浸润，表皮组织已被排斥，评为4级(见图2G，K)，Ⅳ组其他样本组织及Ⅲ组样本皮肤组织未见异常，评为0级(见图2H，L)。

图2 各组发生排斥反应病理学表现

3 讨论

对含皮肤组织的异体复合组织移植排斥反应的研究需要相应的动物模型。大鼠因其大小适中，价格相对便宜，成为此类模型的主要动物之一。使用大鼠建立的CTA实验模型有下肢移植模型［6］、全/半侧颜面移植模型等［7］。大鼠下腹部游离皮瓣包含了皮肤、肌肉、皮下脂肪等多种组织成分，其手术过程简单，操作方便快捷，且包含CTA中免疫原性最强的皮肤组织，是研究CTA的良好模型［8］。我们选择近交系BN和Lewis大鼠分别作为供体和受体，近交系动物是指通过持续20代以上的近亲繁殖，基因已高度纯合化的动物品系。应用近交系动物可以使动物实验的结果正确、可靠、有规律性、重复性好，从而精确判定实验结果、得出正确的结论。这些优点在涉及免疫反应的实验中显得更加重要。

雷帕霉素是一种新型大环内酯类免疫抑制剂，通过阻断IL-2受体信号，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，从而发挥免疫抑制效应。从目前临床应用来看，雷帕霉素是一种疗效好、低毒和无肾毒性的新型免疫抑制剂。理论上雷帕霉素药效是环孢素的40～100倍，同时它的肾毒性却显著降低［9］。移植后，雷帕霉素用量一般呈逐渐减少趋势，即阶梯用药方案。这样可以在保证移植物不被排斥的前提下减少药物的副作用。在CTA后应用雷帕霉素的阶梯用药方案尚未见报道。在本实验中，我们应用雷帕霉素作单药物阶梯用药治疗。术后 4 周，药物剂量维持在 1 mg·kg－1·d－1，除 1 例因排斥反应皮瓣坏死外，其余受体均未发生排斥反应。这一结果与大剂量持续给药的方式相比差异无统计学意义，证实了这一方案的有效性。

异基因移植后的组织和器官免疫抑制用药分为诱导、维持、处理急性排斥反应3个阶段。诱导阶段为移植后初期，这一时期发生的排斥反应强烈。临床上诱导阶段用药品种众多，一般为他克莫司、吗替麦考酚酯和泼尼松三联用药。在单药物治疗的动物模型中，诱导阶段的用药量较大。在大鼠颜面移植模型中，环孢素的用量为术后1周内16 mg/kg，逐周递减，从第4周起维持在2 mg/kg［10］。在本实验中，我们应用雷帕霉素作单药物治疗，前两周保持在4 mg/kg，第3周减半，第4周后维持在1 mg/kg，为初始用量的1/4，即可保持大多数(7/8)受体不发生急性排斥反应。然而，相较于其他器官移植后的雷帕霉素用量(0.2 ～1.0 mg·kg－1·d－1)，1 mg·kg－1·d－1的药物用量还是较高。其原因可能在于皮肤组织具有强抗原性［11］。可能的原因有:(1)皮肤组织中有特异性抗原呈递细胞(朗格汉斯细胞)存在。实验证实，皮肤组织中朗格汉斯细胞的密度与皮肤抗原性密切相关［12-16］。(2)皮肤组织特异性的结构。真皮由胶原和氨基聚糖构成，这些结构包含了大量的淋巴黏附分子，因此可以聚集大量免疫反应。

本实验证实雷帕霉素阶梯用药方案与较大剂量持续给药相比，有相同的抑制排斥反应效果，这一结果为应用这一模型进一步研究CTA的免疫抑制和免疫耐受奠定了基础。

志谢第四军医大学西京医院晏松龄教授在本研究病理学方面给予指导，谨致谢意

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