抵当芪桂汤对STZ诱导糖尿病大鼠vWF、HbA1c的影响*

赵天才，杨景锋，李月红，袁志敏，张 瑛，李 鹏，张瀚元

(陕西中医学院，陕西咸阳 712046)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷所引起的以慢性血葡萄糖(简称血糖)水平增高为特征的代谢性疾病[1]。其发病率高，并发症遍及全身各重要器官。血管病变是各并发症的基础病变，血管内皮细胞功能障碍是形成糖尿病血管并发症的基础[2]。血管性血友病因子(vWF)和糖化血红蛋白(HbA1c)可以有效反映糖尿病血管内皮功能的状态和血糖水平对血管内皮细胞功能的影响。本实验旨在观察抵当芪桂汤(原名抵当四五汤)对糖尿病大鼠vWF和HbA1c含量的影响，探讨该方对糖尿病及其并发症的作用机理，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药品及主要试剂

成年SD雌性大鼠90只，体重200g±20g，由西安交通大学实验动物中心提供，合格证号医动字第2008-08号。抵当芪桂汤由生黄芪、炒白芍、酒大黄、桂枝、水蛭、鬼箭羽组成。给药剂量按照文献方法计算[3]，经常规煎煮、过滤、水浴蒸发至每毫升含生药量分别为0.87g和1.73g的浓缩液，置4℃冰箱保存备用。达美康:天津华津制药厂，批号080405;链脲佐菌素(STZ):sigma公司，批号SO245;血糖试纸:德国罗氏诊断有限公司，批号1630-2005;vWF试剂盒:上海西唐生物技术有限公司，批号081023;HbA1c试剂盒:南京建成生物工程研究所，批号20081120;722E型分光光度计:上海光谱仪器有限公司;全活力型罗康全血糖仪:德国罗氏诊断公司;1379型洗板机:北京宾达英创科技有限公司;RT-2100C型酶标仪:上海光达电器厂。

1.2 模型制备及干预方法

大鼠适应性喂养1周，称体重并经尿糖定性检测为阴性后随机抽取10只为空白组(A组)，其余大鼠用链脲佐菌素(STZ)60mg/kg(STZ溶于0.1mol/L、ph4.2的枸橼酸缓冲液中，配制为1%的溶液)于大鼠禁食12h后1次性腹腔注射，72h后测其血糖值≥16.9mmol/L、尿糖+++～++++以上为造模成功。筛选造模成功大鼠65只随机分为模型组(B组)、达美康组(C组)、抵当芪桂汤组(D组)、抵当芪桂汤加达美康组(E组)、抵当芪桂汤大剂量组(F组)，每组13只。各组大鼠造模后第4天开始灌胃给药，1次/d，连续8周。给药剂量分别为:A、B组:蒸馏水2ml;C组:达美康(2mg/ml)混悬液2ml;D组:抵当芪桂汤(含生药量0.87g/ml)浓缩液2ml;E组:抵当芪桂汤(0.87g/ml)浓缩2ml，30min后给予达美康(2mg/ml)混悬液2ml;F组:抵当芪桂汤(生药量1.73g/ml)浓缩液2ml。

1.3 观察指标及标本采集

每天观察大鼠进食、饮水、尿量及活动情况;给药后第8周末处死动物，右心室取血，其中4ml置以肝素抗凝管中，用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖，比色法测HbA1c;剩余血液置离心管中，4℃离心取血清分装，置－20℃冰箱保存备用，并用ELISA双抗体夹心法检测vWF的含量。剪取心尖部心肌组织用10%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，石蜡切片4μm，脱水透明，HE染色，10×40倍光镜下观察摄片。

1.4 统计分析

用SPSS15.0统计软件进行分析。计量数据以均数±标准差(s)表示，组间比较采用单因素方差分析，相关分析采用简单线性相关分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠的一般状况

造模前各组大鼠精神状态、饮食、尿量正常，均反应灵活，动作自如。造模后大鼠表现为多饮、多食、多尿，形体消瘦，嗜睡少动，精神倦怠。给药8周后，C、D、E、F组多饮、多食、多尿症状有不同程度减轻，精神状态好转，与A组比较次之;B组上述症状变化不明显。

2.2 抵当芪桂汤对大鼠空腹血糖的影响

表1显示，造模3d后与空白组比较，STZ诱导糖尿病模型大鼠空腹血糖明显升高(P<0.05)，表明造模成功。干预结束后，与B组比较各干预组大鼠空腹血糖均明显下降(P<0.05)，其中以C组下降明显。

表1 治疗前后各组大鼠空腹血糖含量比较(s)

表1 治疗前后各组大鼠空腹血糖含量比较(s)

注:*P<0.05 vs.A group，#P<0.05 vs.B group.A:blank control group，B:model group， C:diamicron group D:Di-Dang-Qi-Gui Decoction group E:Di-Dang-Qi-Gui Decoction and diamicron group F:maximum dosage group of the Decoction，the same below

Group n Blood Glucose(mmol/L)3rd day 8th week A 10 6.26±0.44 5.95±0.58 B 11 23.43±3.07* 25.55±2.72*C 12 21.09±2.05* 13.34±2.76*#D 13 22.54±3.36* 19.49±3.09*#E 13 23.51±2.44* 19.28±4.90*#F 13 21.91±3.05* 20.38±5.11*#

2.3 抵当芪桂汤对大鼠vWF、HbA1c含量的影响

表2显示，干预结束后与A组比较，B组vWF、HbA1c明显升高(P<0.05)，表明糖尿病血管病变中vWF随着HbA1c增高而急剧增高;与B组比较，各干预组大鼠vWF、HbA1c含量均降低，其中以D组降低最为显著(P<0.05)，D组与C组相比差异显著(P<0.05)。

表2 治疗8周后各组大鼠vWF、HbA1c含量比较(s)

表2 治疗8周后各组大鼠vWF、HbA1c含量比较(s)

*P<0.05 vs.A group，#P<0.05 vs.B group，<0.05 vs.C group

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2.4 vWF、HbA1c的相关性分析

图1显示，对vWF、HbA1c的相关性进行分析，可以看出随着HbA1c的升高，vWF呈现急剧升高的趋势，其相关系数为r=0.9692(P<0.0001)，具有明显的正相关关系。

图1 大鼠vWF与HbA1c的相关关系图

2.5 各组大鼠心肌组织形态特征的变化

图2显示，正常大鼠心肌细胞排列整齐致密，细胞间质较少，细胞核分布均匀一致，肌纤维整齐，无明显断裂。STZ诱导糖尿病模型大鼠心肌细胞排列紊乱，间质及间质胶原较多，间质纤维化明显，肌纤维部分断裂。经干预后各组大鼠的心肌细胞排列紊乱有不同程度的恢复，其中以C组和D组恢复较为明显。

图2 各组大鼠心肌组织结构图(HE×400)

3 讨论

糖尿病因代谢紊乱引起血管内皮细胞损伤，内皮介质的异常释放是内皮细胞损伤和功能紊乱的标志[4、5]。vWF是由内皮细胞合成和分泌的一种糖蛋白，贮存于血管内皮细胞(Weibel-palade)的小体、血小板及血浆中，其主要参与凝血机制和活化血小板的功能[6]。高血糖时可使血管内皮细胞受损，血浆vWF含量升高[7]。vWF是内皮细胞损伤及功能障碍的标志物，在血小板与血管壁的结合中起重要的桥梁作用。当血小板活化时，vWF一端与血小板膜糖蛋白Ib结合，另一端与血管壁纤维连接蛋白及胶原结合，使血小板能牢固地黏附在血管内皮下，血管受损，基底膜胶原暴露，除激活因子xII启动内原性凝血机制外，内皮细胞还表达并释放vWF导致血小板在损伤部位黏附聚集形成血栓，阻塞血管腔，造成微循环障碍，使血管内皮功能异常，从而参与糖尿病血管病变的发生和发展[8]。糖化血红蛋白(HbAIc)可监测血糖长期控制情况，也能反映体内糖代谢情况[9]。是血红蛋白A组分的某些结构与葡萄糖的非酶促反应结合而形成的产物，体内血糖升高能加速HbA1c的这种生理过程，使血红蛋白与2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的结合减低，血红蛋白对氧的亲合力增高，氧离曲线左移，造成组织缺氧，致使血管内皮细胞代谢障碍受损而形成糖尿病血管病变[10]。

本实验结果显示，随着血糖的增高，HbA1c逐渐增高，vWF也随着HbA1c的增高而急剧增高，表明糖尿病血管病变的发生与糖尿病血糖水平的高低呈现明显的正相关关系，且与相关报道相符[11]。达美康在降低血糖方面疗效显著，而在降低vWF方面却不及抵当芪桂汤，考虑抵当芪桂汤在降低vWF方面可能还有着多层次的作用靶点。而抵当芪桂汤不同剂量对实验大鼠有不同程度降低vWF和HbAlc含量的作用，提示中药的量效关系也是本方进一步研究的重点，其中抵当芪桂汤正常剂量组治疗效果优于抵当芪桂汤加达美康组和抵当芪桂汤大剂量组，考虑可能与实验动物的耐受性有关。

糖尿病是慢性病理过程，可有阴虚热盛-气阴两虚-阴阳两虚的演变。因久病多虚，久病多瘀，最终导致气阴两虚、脉络瘀阻。糖尿病血管病变是在阴虚热盛的基础上发生和演变的，同时伴有脉络瘀滞。当病邪侵袭脉络伤及络气，使络气郁滞导致津血互化障碍，津凝为痰，血滞为瘀，痰瘀阻滞络脉，血行不畅，从而形成痰瘀阻络的病理状态。气血耗损无以荣养络脉，致络虚不荣伤及形质。抵当汤芪桂汤是以张仲景抵当汤、黄芪桂枝五物汤化裁而成，方中生黄芪益气固表，炒白芍养阴生津为君药;酒大黄活血化瘀，水蛭化瘀通络，桂枝温通经脉为臣药;鬼箭羽活血化瘀为佐药，诸药合用，共奏益气养阴、化瘀通络之功，适用于糖尿病及其并发症属气阴两虚、络脉瘀阻证。现代药理研究证实，黄芪在缺糖缺氧的条件下，具有保护细胞的作用，可以调节多种细胞因子的活性;白芍提取物有抗血栓的作用;大黄有降低血糖和糖化血红蛋白，改善糖代谢的作用;水蛭具有抗凝血、抗血栓的作用;桂枝能增加冠脉血流量，扩张外周血管，改善微循环;鬼箭羽亦有改善血液流变性，降低血糖和调节血脂的作用。

综上所述，vWF是反应血管内皮功能方面的标志蛋白之一，与HbA1c有着密切的联系。抵当芪桂汤通过降低vWF及HbA1c含量以改善血管内皮功能，可能是该方防治糖尿病及其并发症的作用机理之一。

[1]陆再英，钟南山主编.内科学(第7版)[M].北京:人民出版社，2008.770.

[3]孙敬方.动物实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，2004.478.

[4]彭丽，顾明君.血管内皮功能异常的评价方法[J].上海医学杂志，2007，30(12):946-948.

[5]Thorand B，Baumert J，Chambless L，et al.Elevated markers of endothelial dysfunction predict type 2 diabetes mellitus in middleaged men and women from the generalpopulation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(2):398-405.

[6]崔红艳，王芳.2型糖尿病中内皮细胞损伤及血小板功能状态的改变[J].河南大学学报(医学版)，2009，28(1):59.

[7]方朝晖，章红，倪英群.益气养阴活血法对2型糖尿病患者血栓前状态血管内皮损伤的干预研究[J].中国全科医学，2009，12(2B):272-274.

[8]王保岚，张曼华.血管性假血友病因子、血栓调节蛋白与糖尿病肾病的关系研究[J].医学综述，2008，14(5):731-733.

[9]杨光，王丽波，王德才.2型糖尿病患者糖代谢与胰岛B细胞功能关系[J].中国公共卫生，2009，25(4):404-405.

[10]石淑春，彭莉萍，莫殿军，等.糖化血红蛋白、血脂、尿微量蛋白与糖尿病肾病的关系[J].检验医学与临床，2005，2(2):56-57.

[11]钱建忠，魏丽.血管性血友病因子在2型糖尿病血管并发症中的意义[J].江苏大学学报(医学版)，2008，18(5):444-445.