商陆对阿霉素肾病肾小球胞外基质影响的实验研究

李 明，张克非，杨亦彬

（遵义医学院附属医院肾内科，贵州遵义563000）

细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在肾小球内过度蓄积，是肾小球硬化的主要病理特征性变化，且其成分过度蓄积可加速硬化进程，因此减少基质过度蓄积，也是临床治疗肾小球硬化的重点[1]。商陆（pokeberry root）是传统的泻下利水药，动物实验研究表明商陆对肾功能有一定保护作用[2,3]。本研究旨在观察商陆水煎剂是否可减轻ECM蓄积，为其防治肾小球硬化提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠50只，三月龄，体重200±20g，第三军医大学野战外科研究所提供，合格证号（scxk渝20020003）。

1.2 试剂及药品 小鼠抗MMP-2单克隆抗体（批号：567P608C），小鼠抗FN单克隆抗体（批号：1351P11E），兔抗LN多克隆抗体（批号：082A511C），均购自NEOMARKERS公司；阿霉素（10mg/支，批号0411E1，深圳万乐药业有限公司）；商陆水煎剂：贵州本地产野生商陆饮片，按商陆/醋=10/3的比例制成醋炙品，干燥备用（含30%的醋煮商陆毒性最小）[4]，用时按中药常规方法煎煮。

1.3 实验方法

1.3.1 分组 SD大鼠随机分为：①对照组10只；②模型组10只；③模型治疗组，包括商陆组、依那普利组各10只。

1.3.2 制模方法 参照文献[5]：1.5%戊巴比妥纳50mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒在无菌条件下背部切口1～1.5cm，暴露左肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，结扎左肾门血管，切除左肾并缝合切口。术后第1周予阿霉素4mg/kg尾静脉注射，第4周再次注射3mg/kg。对照组：分离左肾脏脂肪包膜，不切除左肾并缝合切口，术后第1周尾静脉注射生理盐水0.5mL，4wk后等量重复注射。

1.3.3 治疗方法 商陆组、依那普利组分别于成模1wk后给予商陆水煎剂4000mg/kg.d、依那普利混悬液4mg/kg.d灌胃，对照组、模型组分别给予等量生理盐水灌胃，每日一次，自由饮食。14wk后将大鼠麻醉处死，取肾脏标本石蜡包埋。

1.4 肾组织病理学检查方法

1.4.1 ECM相对面积 每张PASM染色切片在40倍物镜下随机取20个完整且不重复肾小球，采集肾小球基质着色区，计算肾小球基质面积/肾小球面积比，取均值(Leica分析系统)。

1.4.2 免疫组织化学染色 采用SABC法，实验严格按说明书进行。每张切片在40倍物镜随机取20个完整且不重复的肾小球,Leica分析系统分析，计算肾小球阳性目标面积/肾小球面积，取均值。

2 结果

2.1 ECM相对面积 模型组肾小球系膜区增宽，系膜基质中度至重度增生并呈弥漫性分布，商陆组和依那普利组肾小球系膜基质增生程度较模型组明显减轻，其肾小球ECM相对面积均低于模型组 (P<0.05)，二者间无统计学差异(P﹥0.05)，见表 1。

2.2 免疫组化结果 与模型组比较，商陆组、依那普利组FN、LN肾小球阳性着染面积明显减少（P<0.05），二者无统计学差异（P＞0.05）；商陆组、依那普利组MMP-2在肾小球阳性着染面积明显高于模型组(P<0.05)，商陆组低于依那普利组(P<0.05)，见表2和图1。

图1 FN、LN、MMP-2免疫组化结果

表1 各组大鼠肾小球ECM相对面积比较（s）

表1 各组大鼠肾小球ECM相对面积比较（s）

注：与对照组比较，▲P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

组别 n ECM(%)正常对照组 10 4.31±1.85模型组 10 13.33±2.24▲商陆组 10 7.83±2.60▲△依那普利组 10 6.06±2.02△

表2 各组大鼠肾小球LN、FN和MMP-2相对阳性面积（s）

表2 各组大鼠肾小球LN、FN和MMP-2相对阳性面积（s）

注：与对照组比较，▲P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与依那普利组比较，◆P<0.05。

组别 n FN（%）LN(%)MMP-2(%)正常对照组 10 4.20±1.33 5.21±1.92 39.13±6.52模型组 10 18.36±4.54▲ 20.58±5.74▲ 15.05±4.56▲商陆组 10 8.35±2.69▲△ 10.76±2.98▲△ 27.31±4.88▲△◆依那普利组 10 8.07±2.61▲△ 9.06±4.01▲△ 36.11±3.77△

3 讨论

慢性肾脏病肾小球系膜细胞的增殖及细胞外基质(ECM)的大量堆积是肾小球进展性硬化的两个显著的特征，ECM除促进各种炎性细胞的迁移聚集和增殖，加速硬化进程外，还可调节系膜细胞向成纤维细胞转化，促进硬化进展[1]。ECM积蓄由ECM的合成和降解两方面决定，层粘连蛋白（LN）、纤连蛋白（FN）等是ECM的主要成分，而基质金属蛋白酶-2（MMP-2）是肾脏主要的基质降解酶，在肾脏发生病变时,细胞外基质的正常组成成分可异常表达，而基质降解系统的降解功能亦减退。

单侧肾脏切除加重复注射阿霉素造模被认为是研究系膜增生性肾炎向肾小球硬化转化进程中的一个组间差异小，稳定性和重复性好的实验动物模型[5]。本实验病理检查示模型组肾小球ECM相对面积明显高于对照组（P<0.01），系膜基质中度至重度增生并呈弥漫性分布，毛细血管开放不良，部分肾小球呈局灶节段硬化，与文献报道一致[5]。

慢性肾脏病时因细胞因子、免疫介导、炎症损伤、氧化应激、血流动力学紊乱等可直接或间接导致ECM成分改变。本实验显示模型组肾小球FN、LN表达上调，MMP-2下调，而商陆水煎剂灌胃处理模型大鼠肾小球ECM相对面积较模型组明显减少 (P<0.05)，肾小球 FN、LN 表达降低（P﹤0.05），MMP-2 表达增强（P﹤0.05），提示商陆水煎剂具有下调肾小球LN、FN表达、上调肾小球MMP-2表达、减少ECM过度蓄积。商陆是传统的泻下利水药，现代医学研究证明商陆对免疫系统有重要调节作用，其在慢性肾脏病中的治疗作用也日益受到重视。研究表明商陆可抑制TNF、NO、IL-1、IL-2等炎症介质释放，抑制中性粒细胞、内皮细胞的黏附，显著降低ICAM-1和CD18表达[6,7]，商陆提取物可抑制高糖引起的系膜细胞增殖，减少TGF-β产生[8]，降低实验性糖尿病和系膜增生性肾炎大鼠尿蛋白排泄[2,3]，这些研究结果提示商陆可能通过多种途径调控ECM积蓄。

许多研究已证实ACEI具有较好的减轻ECM蓄积作用[9]。本实验结果显示商陆组在降低ECM相对面积和下调LN、FN的表达与依那普利组无明显差异(P﹥0.05)，但上调肾小球MM-2却低于依那普利（P﹤0.05）,是商陆降低ECM蓄积不如ACEI类药物还是实验技术原因有待进一步研究。

[1]Jarvelainen H,Sainio A,Koulo M,et al.Extracellular matrix molecules:potential targets in pharmacotherapy[J].Pharmacol Rev,2009,61(2):198–223.

[2]Jeong SI,Kim KJ,Choi MK，et al.Alpha-spinasterol isolated from the root of phytolacca americana and its pharmacologicalproperty on diabetic nephropathy[J].Planta Med,2004,70(8):736-739.

[3]张克非，张亮，吴雄飞.商陆皂苷甲治疗大鼠抗-Thy1.1系膜增生性肾炎的实验研究[J].四川大学学报（医学版），2004,35(5):662-664.

[4]金传山，张京生.不同醋量对商陆毒性及药效的影响[J].中成药,2000,22（4）：273-274.

[5]李荣山.现在肾脏病实验技术[M].军事医学科学出版社,2006.70-72.

[6]Xiao Z Y,Zheng Q Y.Effect of esculentoside a on production of interleukin-1、2、and prostaglandin E2 [J].Acta Pharmacol Sin,2004,25(6):817-821.

[7]肖振宇,张俊平,陆峰,等.商陆皂苷甲对细胞间黏附的影响[J].药学学报，2003,38（10）：728-730.

[8]Jeong SI,Kim KJ,Choo YK,et al.Phytolacca americana inhibits the high glucose-induced mesangial proliferation via suppressing extracellular matrix accumulation and TGF-beta production[J].Phytomedicine,2004,11(2-3):175-181.

[9]Naito T,Ma LJ,Yang H,et al.Angiotensin type 2 receptor actions contribute to angiotensin type 1 receptor blocker effects on kidney fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol，2010,298(3):683–691.