间苯三酚法快速测定棉粕中游离棉酚的方法研究

2010-06-07郑清梅温茹淑韩春艳

饲料工业 2010年3期

郑清梅温茹淑韩春艳

棉粕是我国重要的饼粕类蛋白资源，占全国各类饼粕总量的40%以上[1]。棉粕蛋白质含量较高，被广泛应用于陆生动物和鱼类饲料中，是一种具有开发潜力的蛋白质资源。但棉粕中含有游离棉酚（Free Gossypol，FG），具有活性醛基和羟基而有毒性作用，从而制约其在养殖业中的应用[2-6]。因此，棉粕因其棉籽产地、加工等因素影响，导致棉粕中的FG含量有差异。因此，测定棉粕中游离棉酚含量对开发利用棉籽饼粕具有重要意义。

目前已报道的游离棉酚检测方法主要有：间苯三酚法[7]、高效液相色谱法[8]和苯胺法[9]等。其中苯胺法测定棉酚操作较繁琐，条件较难控制且苯胺毒性较强，限制了这种检测方法的应用；高效液相色谱法虽然重现性好、精确度高，但仪器设备昂贵，操作复杂，难以在一般生产企业中推广应用；间苯三酚法测定游离棉酚所需仪器少，具有操作简便、条件要求低、回收率高等优点[7]。敖维平等[7]和唐辉等[10]比较了间苯三酚法和高效液相色谱法测定FG的效果，结果表明间苯三酚法与高效液相色谱法测定的结果相近，可用间苯三酚法代替高效液相色谱法测定棉粕中的游离棉酚。

不同的样品处理方法，对FG的提取量与提取效率有影响。贺秀媛等[11]利用国标测定棉籽饼粕中游离棉酚含量时采用自然浸提的样品处理方法，浸提时间至少需要12 h。朱雷[12]在测定棉粕中FG时，采用自然浸提法处理样品需15 h左右，而超声波法只需10 min。超声波提取法处理样品时，由于超声波的机械破碎和空化作用，能大大缩短浸提时间。敖维平等[7]比较了超声波与恒温振荡两种样品提取方法，认为超声波法效果优于恒温振荡法。因此，本试验分别采用超声波与恒温振荡两种处理方法，探讨浸提时间与温度两因素对间苯三酚法快速测定FG的影响，旨在为棉粕企业及养殖场内部质量检控过程中提供有效方法。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

主要试剂：99%醋酸棉酚（上海融禾医药科技有限公司），间苯三酚（国药集团化学试剂有限公司）、丙酮（分析纯）、苯胺（分析纯）、3-氨基-1-丙醇（分析纯），其他试剂均为国产分析纯。主要仪器：722s分光光度计、2510E-MT超声波洗涤仪（Branson Ultrasonics Corporation）、HZQ-QG全温振荡器。

1.2 方法

1.2.1 棉酚标准曲线的绘制

棉酚标准溶液的配制：准确称取0.050 g醋酸棉酚，溶于70%丙酮溶液溶解并定容至50 ml作为母液。取此母液用70%丙酮溶液溶稀释10倍，相当于每毫升应用液中含棉酚0.1 mg。显色剂配制：准确量取16.6 ml浓盐酸，置于100 ml三角瓶中，加入1 g间苯三酚，加95%乙醇至100 ml，溶解后混合置于棕色瓶中放入冰箱备用。

准确吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8 ml棉酚标准液并依次编号为1～5号放入10 ml试管中，再依次分别加入1、0.8、0.6、0.4、0.2 ml的 70%丙酮溶液，各试管中加入2 ml的显色剂，摇匀，在50～55℃恒温水浴箱中加热5 min。用1 cm比色皿，以70%丙酮溶液调零，在550 nm波长处测定吸光度值（见表1）。

表1 不同浓度棉酚标准液吸光度值

根据棉酚含量(mg)与吸光度值进行回归计算，得回归方程为：y=0.0466x-0.0013(R2=0.9956)，并绘制标准曲线（见图1）。

图1 棉酚标准曲线

1.2.2 样品的处理方法与测定

棉粕用研钵研成粉末并过100目筛后作为样品，分别以超声波与恒温振荡两种方法处理，测定在不同的温度与时间对FG含量的影响。

1.2.2.1 恒温振荡法

A：分别准确称取4～5 g样品，置于具塞锥形瓶中，分别加入约40 ml 70%丙酮溶液，盖上瓶塞，于恒温振荡器上振荡 0.5、1、1.5、2、2.5、3、5 h（当时室温 29℃，转速120 r/min）。静置，用中速滤纸过滤于50 ml容量瓶中，丙酮溶液洗涤并定容至50 ml。然后分别取滤液1 ml置于试管中，各加入2 ml显色剂摇匀，测定方法与标准曲线绘制步骤相同。每个样品在每一个时间点分别做3个重复，取其平均吸光度值，并根据棉酚标准曲线推算出棉粕样品中棉酚的含量。

B：分别准确称取4～5 g样品，置于具塞锥形瓶中，各加入约40 ml丙酮溶液，盖上瓶塞，置于恒温振荡器上以不同的温度（20、24、28、32、36、40、50 ℃）振荡1 h（转速120 r/min），以下操作步骤同“A”。每个样品在每一个温度分别做3个重复，取其平均吸光度值，并根据棉酚标准曲线推算出棉粕样品中含棉酚的含量。

1.2.2.2 超声波法

C：分别准确称取4～5 g样品，置于具塞锥形瓶中，各加入约40 ml丙酮溶液，盖上瓶塞，置于超声波洗涤仪内超声作用 0.5、1、1.5、2、2.5、3、5 h（29 ℃）。以下操作步骤同“A”。

D：分别准确称取4～5 g样品，置于具塞锥形瓶中，各加入约40 ml丙酮溶液，盖上瓶塞，置于超声波洗涤仪内以不同的温度（20、24、28、32、36、40、50 ℃）超声作用1 h。以下操作步骤同“B”。

1.2.3 国标法测定FG

采用国家标准法测定样品中游离棉酚的含量，其具体测定方法按GB 13086—91所描述[13]。

2 结果与分析

结果表明，国标法测定棉粕样品中游离棉酚的含量为361.72 mg/kg。间苯三酚法在浸提时间为1 h，温度为32℃时，恒温振荡法与超声波法的FG测定值约为372.00 mg/kg（如图2B所示），与国标法的测定结果相近，但比国标法快速、简便，稳定性好。

图2 不同的浸提时间（A）与温度（B）对间苯三酚法测定棉粕中游离棉酚(FG)含量的影响

不同的浸提时间对间苯三酚法测定棉粕中游离棉酚（FG）含量的影响如图2（A）所示。浸提时间对恒温振荡法与超声波法提取FG的效果有差异（其浸提温度均为29℃），但该2种处理方法对FC的提取效果相接近。浸提时间为1 h时，两种处理方法的提取量均为285 mg/kg左右，浸提时间为1.5 h，其提取量约为305 mg/kg左右，浸提时间为3 h时，其提取量约为322 mg/kg。随时间的延长，两种处理方法的FG提取量趋于平稳。

不同的浸提温度对间苯三酚法测定棉粕中游离棉酚（FG）含量的影响如图2（B）所示。与浸提时间相比，浸提温度对间苯三酚法测定FG的影响更为显著，且恒温振荡法和超声波法对FG的提取量影响的变化趋势相近。在温度低于28℃时，恒温振荡法和超声波法的FG提取量均较低，其提取量为281 mg/kg左右。当温度升高至32℃时，两种方法的FG提取量均明显增加，其提取量约为372.65 mg/kg。当浸提温度高于32℃，其提取量趋于平稳（浸提时间都均为1 h）。