乙型肝炎患者HBV-DNA定量检测与HBV血清学标志组合的关系

彭及良 ，温秀明 ，许瑞环 ，沈磁石 ，何春辉

（1.广东省深圳市龙岗区血站，广东深圳 518172；2.广东省深圳市龙岗中心医院，广东深圳 518116）

近年来随着分子生物学技术的发展及其在临床应用方面的推广，应用实时荧光定量聚合酶链反应检测 HBV病毒载量已成为目前临床诊断 HBV感染的常用指标，进一步提高了检测的质量。同时采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测乙型肝炎病毒HBV标志（HBV-M）简便易行，一直为许多临床科室使用。临床上有必要把此两种方法的检测结果联合起来进行分析，指导临床应用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2009年6～9月来我院住院及门诊的423例患者，年龄13～66岁。所有标本用无菌管留取血样3 ml，于3 h内分离血清，并冻存于20℃冰箱。

1.2 主要试剂

HBV-DNA定量诊断试剂由深圳市匹基生物技术公司提供。HBV-M测定用酶联免疫吸附试验（ELISA），试剂由上海科华生物工程公司提供。

1.3 检测方法

1.3.1 ELISA法 按试剂说明书进行。

1.3.2 荧光定量PCR法检测HBV-DNA①样本处理，取待测血清或血浆样本以及试剂及试剂盒中的对照各100μl，分别加到0.5 ml离心管中，100μl DNA提取液1，振荡混匀，13 000 r/min离心 10 s，25μl DNA 提取液 2，振荡 10 s，200 r/min 离心 10 s，100℃干浴或沸水浴 10 s，13 000 r/min离心10 s，保留上清备用。②反应体系为40μl：37.6μl PCR反应液、0.4μl Taq酶、0.06μl VNG及2μl提取物。③循环条件为：37℃ 5 min、94℃ 1 min、95℃ 5 s，60℃ 30 s 42 个循环。荧光信号收集在60℃。

1.3.3 污染的控制 标本的处理、试剂的配制、上样及PCR扩增检测严格分室进行，每次检测均设强阳性、临界阳性、阴性、质控试剂参照品。

1.4 检测仪器

美国ABI公司生产的ABI7500荧光定量PCR仪，芬兰Labsystems生产的Multiskan MK 3酶标仪。

1.5 统计学方法

对所得数据进行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBsAg（+）组与 HBsAg（-）组 HBV-DNA 阳性率的比较

324例血清标本HBV-DNA表达情况见表1。

表 1 HBsAg（+）组与 HBsAg（-）组 HBV-DNA 阳性率的比较（%）Tab.1 The comparasion of HBV-DNA between HBsAg（+）group and HBsAg（-）group(%)

由表1可见，HBsAg（+）组HBV-DNA阳性率为78.4%，有21.6%的阴性率。HBsAg（-）组HBV-DNA阴性率为95.1%，有4.8%的阳性率，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 HBV-M不同模式的HBV-DNA检测结果

324例血清标本HBV-M不同模式的HBV-DNA检测结果见表2。

表2 HBV-M不同模式的HBV-DNA检测结果Tab.2 Theresultsof HBV-DNA under HBV different serological makers

由表2可见血清HBsAg HBeAg HBcAb阳性组合HBVDNA阳性率为 100.0%，拷贝数达到 1.61×107拷贝/ml。HBsAg、HBcAb、HBsAg HBeAb HBcAb、HBsAb、HBeAb、HB-cAb阳性率依次降低。

3 讨论

酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎病毒已成为临床常规。乙肝五项的检测为临床提供一定的信息[1-3]，但对HBsAg阴性者，本实验发现有5%的 HBV-DNA阳性，且拷贝数在104拷贝/ml左右，与某些文献报道相似[4-5]。其原因可能由于：①HBV发生变异，其前S区变异率比S区高2倍；前C/C区变异研究较多。②HbsAg的表达可能较低或其抗原性改变较大，用现有的试剂检测不出。③形成免疫复合物，有人发现血中免疫复合物的存在可能影响HbsAg的检出[6]。

乙型肝炎病毒DNA拷贝数可真实反映HBV感染的状况[7-9]，本试验结果为 HBsAg（+）HBeAg（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA全部阳性，平均含量为 1.61×107拷贝/ml；HBsAg（+）HBeAb（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA 阳性率为 47.0%，平均含量为 3.42×104拷贝/ml；HBsAg（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA阳性率为69.0%，平均含量为6.32×104拷贝/ml，而 HBsAb（+）HBeAb（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA阳性率为5.2%，平均拷贝数为4.12×104拷贝/ml，由此可以看出血清中乙型肝炎病毒DNA拷贝数与其血清学指标组合是相匹配的，对乙型肝炎的临床诊断，特别是对其疗效有较大的指导意义[10-11]。本实验发现HBsAg（+）HB cAb（+）的阳性率为 69.0%，比 HBsAg（+）HBeAb（+）HBcAb（+）的阳性率（47.0%）高，且差异有统计学意义（P＜0.05），有两种可能解释，一是HBV复制减少或停止，一是HbsAg前C基因发生变异。根据Ferruccio Bonino来华报道，急性乙型肝炎时 HBV 标志物的变化图显示 HBsAg（+） HBeAb（+）HBcAb（+）时的 HBV-DNA 阳性率明显低于 HBsAg（+）HBcAb（+）时的HBV-DNA阳性率。

本实验所用的BIO-RADicycler荧光定量PCR技术灵敏度高，操作简单，克服假阳性结果，无需PCR后处理，防污染效果好，可直接反映病毒在体内的存在情况，已为临床普遍应用。血清学ELISA方法是检测病毒侵染机体产生的免疫反应，间接反应病毒的感染状况。对于 HBeAg与 HBV病毒载量之间的关系，一般认为两者的水平存在一定程度的一致性。本试验显示两者既有相关，又不尽一致，临床上需要将两者结合起来对患者进行诊断和治疗。

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