甲真菌病的3种实验诊断方法研究

胡记妹，曾军荣，梁海燕，邝家熙

（广东省从化市中心医院检验科，广东从化 510900）

甲真菌病（onychomycosis）是南方地区最常见的甲病，通常认为甲真菌病在人群中的发病率为3%～5%[1]，占真菌病的20%～30%[2]。甲屑直接镜检和真菌培养是公认的诊断甲真菌病的“金标准”，但受取材的质和量等因素的影响，两者结合诊断的阳性率＜70%[3]。近年来开展了剪取病甲做组织病理学检查[4]及PCR检测[5]，使查菌的阳性率得以提高，但却存在制作复杂、耗时长等缺点，限制了它们的推广。临床上迫切需要一种准确、简便、快速、价廉、易行的方法用于甲真菌病的诊断。为探索一种操作简易、实验结果可靠的检验方法诊断甲真病，笔者采用20%KOH浸软病甲真菌镜检（简称浸软法）从甲标本中检测真菌，并与直接镜检法、真菌培养法（简称培养法）进行比较。

1 资料与方法

1.1 一般资料

121例均为2006年9月～2009年10月来我院皮肤科门诊就诊的患者，入选患者均符合甲真菌病的诊断标准[6]。其中，男 59例，女 62例；年龄 17～65岁，病程 30 d～24年，平均4.2年。观察病甲数目432份，靶甲数目121份，伴手足癣38例，有甲板外伤史12例。受检前1个月内均未接受过局部和系统抗真菌药物治疗。

1.2 标本采集

以75%酒精消毒病甲表面后，用消毒手术刀刮弃表层甲屑，刮取和剪取拟诊为甲真菌病的靶甲及甲下碎屑，分为3份，其中，81份病甲标本取自远端侧缘甲下型，40份取自全甲毁损型。

1.3 方法及判断标准

刮取其病甲远端边缘和甲床皮屑进行传统的KOH直接镜检[6]，同时剪取病损指、趾甲末端少许标本做浸软法真菌镜检和真菌培养。3份标本分别按下述3种方法处理：

1.3.1 直接镜检法 取刮下甲屑于载玻片上，加10%KOH 1滴溶解，10 min后观察，Olympus光学显微镜下见菌丝和（或）孢子者为阳性。皮肤癣菌：菌丝较细、规则、分隔、分枝，可见关节孢子。酵母菌：可见酵母细胞团、芽生孢子及假菌系。真菌：菌丝粗大，不规则，可见特殊结构。

1.3.2 培养法 采用两管法，即甲屑同时接种于含氯霉素和放线菌酮的沙氏培养基与含氯霉素、不含放线酮的沙氏培养基（以上培养基均为自制），每管最少接种3点，置25～27℃培养，随时观察培养情况。4周以上无菌落生长判定为阴性，有菌落生长者，皮肤癣菌及真菌的鉴定主要依据菌落形态、颜色等以及Olympus光学显微镜镜检鉴定，鉴定标准参照《医学真菌学——实验室检验指南》[7]，念珠菌属用API20cAux试剂盒（法国BioMerieux公司）鉴定到种。

1.3.3 浸软镜检法 将病甲标本置入20%KOH溶液中56℃40～50 min，待病甲标本完全浸透软化呈蛋白胨状，吸出多余的KOH液后，将标本放在载玻片上，用盖玻片轻轻将标本压平、压薄呈云雾状或毛玻璃状，在Olympus光学显微镜下见菌丝和（或）孢子者为阳性。皮肤癣菌：菌丝较细、规则、分隔、分枝，可见关节孢子。酵母菌：可见酵母细胞团、芽生孢子及假菌系。真菌：菌丝粗大，不规则，可见特殊结构。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件分析，行χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 直接镜检法结果

121例拟诊患者甲标本中，真菌阳性者58例（47.9%）。

2.2 培养法结果

121例拟诊患者甲标本培养出72例（59.50%）共80株真菌，单一感染69例（95.83%），混合感染3例（4.17%）。菌种分布情况见表1。

表1 121例甲真菌病真菌培养结果Tab.1 The results of 121 onychomycosis by fungal culture

2.3 浸软镜检法

121例拟诊患者甲标本中，118例（97.52%）检出真菌成分，检查结果：孢子、菌丝形态初步提示为皮肤癣菌110例（91%），初步提示为酵母菌36例（30%），初步提示为真菌48例（38%）。其中2种或2种以上真菌混合24例。

3种方法检出结果见表2。

表2 121例疑甲真菌病3种方法检查结果[n(%)]Tab.2 The results of 121 onychomycosis by three tests[n(%)]

三种方法检出率差异有高度统计学意义（χ2=75.247，P＜0.001），直接镜检法与培养法检出率差异无统计学意义（χ2=3.258，P＞0.05）。浸软法镜检检出率高于直接镜检法，两者比较，差异有高度统计学意义（χ2=51.829，P＜0.001）；浸软法检出率高于培养法，两者比较，差异有高度统计学意义 （χ2=75.00，P＜0.001）。

3 讨论

甲真菌病指甲板、甲床和甲周围组织的真菌感染，国内发病率约为15.6%[8]，是皮肤科常见病、多发病，但误诊、漏诊患者时有发生，在系统治疗前，采用切实可行的诊断方法证实甲真菌感染十分重要。笔者采用直接镜检法、真菌培养及浸软镜检法进行了对比研究，结果显示，浸软镜检法明显高于直接镜检法和真菌培养，与文献报道一致。

虽然传统的KOH直接镜检法和真菌培养操作简单，但阳性率较低，分别为50%～75%和25%～80%[9]，容易出现假阴性；组织病理法阳性率为99.44%[10]，但要求条件高、操作复杂、时间长。直接镜检检出率较低，本研究中直接镜检检出58例（47.9%），但该方法快速、方便，可直接明确有无真菌感染。真菌培养虽为诊断甲真菌病的“金标准”，但是由于无活性休眠菌丝及甲标本暴露于空气中，污染机会较多，影响结果的准确性，造成培养阳性率低。培养法耗时虽较长，但可鉴定菌种，进行药敏试验对药物的选择有一定的指导意义，如克柔念珠菌对氟康唑天然耐药。组织病理法阳性率高于直接镜检和培养法，能观察到真菌在甲中寄生的状况，可对病原菌作出初步分类，并可对银屑病等病甲明确诊断，但要求条件高、操作复杂、时间长，因真菌在病甲内分布稀疏不均，往往需要多层面切片寻找方可避免假阴性结果，镜下菌体往往呈横断面或节段状，还需特殊染色（PAS染色）方易区别，甲切片对切片刀磨损大，制片过程需1周，对实验人员的实验组织病理学技术要求较高，使该法推广受限。浸软法真菌镜检与甲组织病理法比较，具有患者无痛苦、操作简便、经济、快速、镜下病甲内的真菌生长形态完整、无需特殊染色、低倍镜下即可观察到病甲内原始状分布的菌丝或关节菌丝的特点。张文娟等[11]提出应用KONCPA法诊断甲真菌病，笔者对此法进行了研究，20%KOH浸软镜检法是一种检出率高、可行性强的甲真菌病诊断方法。结果提示，组织病理学检查和20%KOH溶甲法可弥补甲真菌病诊断中真菌直接镜检和真菌培养法的不足，显著提高诊断阳性率和准确率。该法较甲病理法[9]诊断甲真菌病简便、快速，易于操作，门诊患者可无需固定步骤，制作湿片即可行镜下观察出报告，完成1份标本所需时间为1 h左右，在日益繁忙的皮肤性病科门诊中具有推广价值，建议临床推广应用。

[1]余进,李若瑜.国内甲真菌病病原学的流行病学调查[J].中国真菌学杂志,2006,1(1):63-64.

[2]Haneke E,Roseeuw D.The scope of onychomycosis:epidemiology and clinical feature[J].Int JDermatol,1999,38(Suppl 2):7-12.

[3]Daniel CR.The diagnosis of nail fungal infection[J].Arch Dermatol,1991,12(7):1566-1567.

[4]牛云彤,李少平.甲真菌病的诊断[J].中国麻风皮肤病杂志,2004,20(1):57-58.

[5]李筱芳,田伟,王红,等.多重PCR快速诊断甲真菌病[J].国际皮肤性病学杂志,2007,33(4):197.

[6]王光超.皮肤病及性病学[M].北京:科学出版社,2002:264.

[7]王端礼.医学真菌学——实验室检验指南[M].北京:人民卫生出版社,2005:137-289.

[8]中华医学会皮肤病学分会.皮肤科就诊患者足病情况调查[J].中华皮肤科杂志,2000,33(1):55.

[9]张文娟,蔡永明,桑菊花,等.甲真菌病组织病理学检查及其意义[J].中华皮肤科杂志,1996,29(5):352-353.

[10]Liu HN,Lee DD,Wong C,et al.A new method for diagnosing tinea unguium[J].Dermatology,1993,18(7):166.

[11]张文娟,蔡永明,桑菊花,等.改良KONCPA法诊断甲真菌病的研究[J].中华医学检验杂志,1997,20(4):254.