山东省1例人粒细胞无形体病的确认与调查*

李 忠,丁淑军,吕 慧,陈 勇,侯配强,王显军

人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)是由嗜吞噬细胞无形体侵染人末梢血中性粒细胞引起,以发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损害为主要临床表现的蜱传人畜共患传染性疾病〔1-2〕。该病呈世界分布,但报道主要来自欧美地区〔3-4〕。近年分子生物学证据及血清学证据都证实亚洲许多国家包括日本、韩国以及我国存在有该病〔5-6〕。2006年我国安徽省首次发生院内无形体传播感染事件〔7〕。在一项针对我国天津地区高危人群的调查结果显示,我国农牧区从事农作物生产及畜牧业养殖人群无形体血清流行率达8.8%〔8〕。2008年5月下旬,我中心对泰安市疾控中心报告的1例不明原因发热、伴白细胞和血小板减少病例进行了流行病学调查,并采集其血液标本开展了实验室检测,结果如下。

1 病例发现经过与治疗

患者 xxx,女,41岁,汉族,泰安市新泰人。2008年5月11日不明原因开始出现发热,最高达40℃,全身乏力。在当地医院使用替硝唑、左氧氟沙星、阿奇霉素等药物治疗,用药后第4d出现呕吐,遂到泰安市某医院就诊,给予对症处理。5月18日7:00pm,突然出现昏迷,入住当地某医院。5月19日中午转到泰安市中心医院以“系统性红斑狼疮”收住院。入院诊断:“系统性红斑狼疮?、狼疮性脑病?、血液系统损害、肾损害”。入院时神志淡漠,烦躁,呈现昏迷状态。入院后血常规检查:白细胞(1.95×109/L)和血小板(84×109/L)减少;尿蛋白阳性;转氨酶升高;心肌酶谱升高。骨髓涂片示增生活跃,粒系增生,部分粒细胞浆中可见多少不一的粗大紫红色颗粒及空泡。血涂片示白细胞数减少,粒细胞比例减低,可见异型淋巴细胞。血小板散在可见。临床上排除了常见发热疾病后,考虑到患者发热,白细胞、血小板同时降低,且肝功转氨酶升高,根据卫生部2008年初下发的《人粒细胞无形体病预防控制技术指南(试行)》,中心医院诊断为人粒细胞无形体病疑似病例,为求进一步明确诊断,邀请省卫生厅组织临床和疾控专家会诊。入院后经医院补液、应用头孢哌酮钠舒巴坦钠、左氧氟沙星、复方甘露醇等治疗不见好转,仍高烧不退、病情加重;会诊后,使用强力霉素等抗立克次体感染药物以及补液、输血、物理降温等对症治疗后,神志转清,口齿逐渐清晰,40余天后痊愈出院。

2 流行病学调查

患者所在的村为一自然村,100多户人家,340-350人,以农作物种植、养蚕为主要收入来源,属于丘陵地带。平日在家务农,有20余亩地,种植有花生、核桃、地瓜、杨树等农作物。院子门口有野草,屋后为庄稼地。家中饲养2只狗,1只羊,在其中1只狗和羊身上发现有蜱,狗在屋后庄稼地里饲养,狗身上发现众多蜱寄生,捕获后初步鉴定为硬蜱。患者家居住在村西南边,家中卫生条件一般。发病前无外出史。临床考虑为人粒细胞无形体感染后,追问有无蜱叮咬史,但患者自述发病前无蜱叮咬史。

3 实验室检测

无菌采集患者发病早期非抗凝血液标本以及EDTA抗凝血标本各3～5ml,血清分离后与抗凝血一同置-20℃保存作PCR检测和核酸序列测定分析。PCR试剂盒(Taq聚合酶、dNTP、Buffer和DNA ladder)均购自大连宝生物工程有限公司,有效期内使用。PCR仪为Biorad公司产品。PCR阳性对照由中国疾病预防控制中心传染病防制所立克次体室张丽娟老师惠赠。实验引物针对无形体16S rRNA基因设计。外引物Eh-out1(AF414399)序列:5'-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3';Eh-out2(AF414399)序列:5'-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3';内引物HGA1和HGA2是无形体特异性引物,HGA1序列:5'-GTC GAA CGG ATT AT T CT T TAT AGC T TG-3';HGA2序列:5'-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3'。外引物扩增片断长度为653bp,内引物扩增片段长度为389 bp。DNA提取采用Qiagen公司生产的 DNA Blood Mini Kit对病例的抗凝血标本提取模板DNA,具体步骤参见操作说明书,最后采用AE缓冲液50μL抽滤以提高回收的 DNA浓度。套式PCR第一轮PCR反应:反应体系为25ul,其中buffer 2.5μL,dNT P 2μL,Eh-out1 和 Eh-out2 各 1μL,TaqE 0.125μL,DNA 模板 3μL,余用蒸馏水补足。反应条件第一轮94℃预变性5min,94℃变性45sec,55℃退火 50sec,72℃延伸1min,共40个循环,最后72℃总延伸5min。第二轮PCR反应取第一轮扩增产物1μL,HGA1和 HGA2引物各 1μL,其余反应参数不变。采用1%琼脂糖凝胶电泳第二次PCR扩增产物,凝胶成像系统拍照。

取第二次PCR扩增产物50μL送Invitrogen公司作核酸序列测定分析。通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)站点后,利用“BLAST”工具,与GenBank中注册的HGA基因序列进行同源性比较。

4 结 果

4.1 临床化验检查 血常规:白细胞波动在1.95×109/L～2.73×109/L之间,治疗后,白细胞上升到6.15×109/L;血小板波动在34×109/L～84×109/L之间;血红蛋白波动在64g/L～112g/L。谷丙转氨酶最高达 284U/L,谷草转氨酶最高达969U/L,总蛋白最低为 57.9g/L、白蛋白最低为27.4g/L。肌酸激酶最高为1276U/L,肌酸激酶同工酶58U/L,乳酸脱氢酶989IU/L,α-羟丁酸脱氢酶807IU/L,均升高。肾功检测包括尿素(5.16mmol/L)及肌酐(105umol/L)均正常,尿蛋白 1.0/L。腰椎穿刺检查:脑脊液压力高,糖、蛋白、氯化物均高,未查见隐球菌及抗酸杆菌。血淀粉酶升高(605U/L)。

4.2 PCR电泳 以病人血液标本提取的DNA为模板,行套式PCR。琼脂糖电泳结果显示,PCR扩增产物约400bp大小,与阳性对照一致,见图1。

4.3 序列分析结果 将第二轮PCR产物进行序列测定,见图2,并将所获得序列提交到GenBank,序列号为Gu908492。测定结果输入BLAST分析工具,进行同源性比较。结果发现扩增片段与我国已报道的从浙江、吉林鼠中扩增的相对应序列(基因注册号为DQ458808、DQ449948)相差1个碱基,同源性为99.7%,变异发生在117位碱基。根据卫生部《人粒细胞无形体病诊疗方案(试行)》,全血或血细胞标本PCR检测嗜吞噬细胞无形体特异性核酸阳性,且序列分析证实与嗜吞噬细胞无形体的同源性达99%以上,是确诊无形体病的主要实验室依据之一。

图1 PCR电泳结果1:DL2000 Marker;2:阴性对照;3:血标本;4:阳性对照;5:DL2000 M arkerFig.1 Electrophoresis of PCR products1:DL2000 marker;2:negative control;3:Blood sample;4:Positive control;5:DL2000 Marker

图2 PCR产物测序图谱Fig.2 Sequencingmap of PCR product

5 讨 论

患者为中年女性,居住丘陵地带,家中饲养的狗、羊身上以及周围环境中发现有蜱生存,卫生条件较差,存在被蜱叮咬的可能性,有流行病学接触史。患者发病急,以发热、乏力等非特异症状为临床首发表现,常规用药效果不佳,且病情进展比较快,很快出现昏迷等神经系统症状。临床化验室检查,血常规检测发病早期白细胞、血小板数均低于正常范围,为无形体病早期诊断指标;肝功指标显示谷丙转氨酶最高达284U/L,谷草转氨酶最高达969U/L,均远远高于正常值4倍以上,同时总蛋白、白蛋白均降低,指示肝功能受损;心功能指标肌酸激酶最高为1276U/L,肌酸激酶同工酶58U/L,均高于正常范围,提示心功能亦受累及。肾功检测指标尿素及肌酐虽正常,但尿蛋白阳性,为1.0/L,提示肾功能亦有改变。腰椎穿刺时,脑脊液压力高,糖、蛋白、氯化物均高,支持中枢神经系统感染,但未查见隐球菌及抗酸杆菌,排除了常见的隐球菌性脑膜炎和结核性脑膜炎。血淀粉酶605U/L,较正常值升高,提示胰腺功能改变。多项实验室检测显示该病例合并有肝、肾、心、神经系统多器官、多系统功能损害。采其抗凝血进行套式PCR检测,无形体核酸检测阳性,且经测序证实与无形体同源性在99%以上,从病原学上亦得到了支持的证据。该病例有流行病学接触史,临床上有发热、乏力等表现,实验室检测有白细胞、血小板降低,肝功转氨酶明显升高,病原学HGA核酸检测阳性,且经测序证实。根据卫生部《人粒细胞无形体病预防控制技术指南(试行)》的诊断标准,该病例为人粒细胞无形体确诊病例。

自1994年美国报告首例人粒细胞无形体病病例以来〔1〕,美国每年报告的病例约600～800人。目前美国多个州和欧洲多个国家都报导有人粒细胞埃立克体感染存在的证据。1999年以来高东旗等〔9〕报道从新疆的全沟硬蜱扩增出人粒细胞埃立克体(2003年后国际统一命名为人粒细胞无形体)特异性DNA片段;2001年,高东旗等〔10〕又从内蒙古大兴安岭采集的发热病人血中扩增出人粒细胞埃立克体16S rRNA,说明我国存在着HGA感染病例。该病为一新发传染病,目前对该疾病的病原学、发病机制、传播途径、临床表现及治疗方面的认识尚不足,临床上容易误诊为其他发热性疾病。如果不能及时明确诊断,由于该病病情进展比较快,往往造成病人多器官受累,增加死亡率。因此,加强该病的临床诊治水平及疾病检测能力具有重要的现实意义。

感谢中美新发传染病合作项目(No.1U2GGH000018-01)的技术支持,感谢泰安市疾控中心、新泰市疾控中心参与调查并对该调查给予大力支持!

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