细粒棘球绦虫(中国大陆株)亲肌肉抗原重组蛋白的免疫保护性研究*

马 锐,师志云,李昭宇,王娅娜,李宗吉,赵 巍

囊性包虫病(cystic echinocoecosis,CE)是由细粒棘球蚴绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)幼虫引起的一种人畜共患寄生虫病,虽呈全球性分布,但主要流行于高原和气候寒冷的畜牧业地区,如亚洲,非洲,欧洲,北美洲、澳大利亚等〔1〕。据 WHO 报告〔2〕:发病最为严重的北非突尼斯人群的发病率为1.5～2.05/10万。我国是包虫病发病最高的国家之一,以疆、青、甘、宁、藏、内蒙和川西较为严重。疫苗防治是控制包虫病流行的最有效的方法〔3-4〕。本课题小组根据GenBank公共数据库检索出细粒棘球蚴亲肌肉抗原基因的已知序列并设计引物,通过RT-PCR技术克隆出目的基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中表达重组蛋白(rEgmyophilin),研究证明原核表达的重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性〔5-6〕。本次研究以Egmyophilin为候选疫苗抗原分子免疫小鼠,细粒棘球蚴原头蚴攻击后观察其诱导的免疫保护力和抗体水平,为疫苗研制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6-8w龄雄性ICR小鼠,体重(18±2)g,共24只,购自宁夏医科大学实验动物中心。

1.1.2 细粒棘球蚴原头蚴 从宁夏医科大学附属医院肝胆外科包虫病患者手术摘除的完整包囊中无菌条件下抽取囊液,分离原头蚴,经PBS(pH7.2)洗涤3次后,弃去上清液,用0.5%伊红染色计数原头蚴的着色率及形态,原头蚴的存活率＞90%,用PBS配成1.5×104个原头蚴/mL悬液,用于攻击感染ICR小鼠。

1.1.3 细粒棘球蚴重组蛋白Egmyophilin:由本室构建〔5-6〕。

1.1.4 主要试剂 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b IgG3和 IgE 购自华美生物工程公司北京分公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及免疫 将ICR小鼠随机分为蛋白免疫组和佐剂对照组,每组12只。两组小鼠在0、2、4w各免疫1次,共 3次,第1次基础免疫注射10 μ g rEgmyophilin和等量弗氏完全佐剂,以后 2次为加强免疫均用10 μ g rEgmyophilin和等量弗氏不完全佐剂。佐剂对照组免疫方案相同,只注射弗氏佐剂和PBS。两组均采用背部皮下多点注射免疫,每次注射量为 100μL/只。于 0、2、4、8w 从鼠尾各采血1次,将血液4 000 r/min离心 10 min,吸取血清,-85℃保存。

1.2.2 攻击感染 第3次免疫后2w,蛋白免疫组和佐剂对照组每只小鼠用1 500个活棘球蚴原头蚴腹腔内注射进行攻击感染。攻击感染20w后剖杀小鼠,眼球采血,分离血清。至实验结束时,蛋白免疫组有2只小鼠死亡,佐剂对照组有3只小鼠死亡。

1.2.3 观察免疫保护力指标

1.2.3.1 免疫保护力 活棘球蚴攻击感染20w后剖杀两组小鼠,切开小鼠腹部,称取小鼠脾脏,计算脾指数,公式:脾指数=脾的重量(mg)/小鼠体重(g);计数肝脏及肠系膜处的棘球蚴包囊,根据Dempster〔7〕计算免疫保护力 ,公式:免疫保护力(%)=(1-免疫组平均包囊数/对照组平均包囊数)×100%。

1.2.3.2 常规ELISA检测IgG及其亚型和IgE抗体 用终浓度为10 μ g/mL rEgmyophilin—碳酸缓冲液(pH 9.6)包被96孔酶标板,100μL/孔,4℃过夜;次日用PBS洗板3次,5%脱脂奶粉37℃封闭2 h;加1∶100稀释的蛋白免疫组鼠血清,100μL/孔,37℃反应2 h,PBS洗板3次;加入1∶1000稀释的羊抗鼠 Ig-H RP 100μL/孔,37 ℃反应 2 h,PBS洗板3次;加四甲基联苯胺(TMB)底物溶液,15 min后用2 mol/L H2SO4(50μL/孔)终止反应,用酶标分析仪测定每孔A450值。

1.2.4 统计学处理 采用SPSS 11.0软件进行分析,组间比较用单因素方差分析(ANOVA)。

2 结 果

2.1 rEgmyophilin诱导小鼠抗包虫感染的保护作用 蛋白免疫组和佐剂对照组的棘球蚴包囊平均直径分别为0.8mm和7.8mm,包囊数目分别为0.74±2.10和7.83±17.21个,同时rEgmyophilin免疫ICR小鼠可获得94.46%的免疫保护力。

2.2 蛋白免疫组小鼠IgG及其亚型和IgE抗体检测结果 蛋白免疫组小鼠血清IgG、IgG1和IgE水平,免疫后与免疫前相比均明显增加(F=1456.48、6.99、49.84,P＜0.05),感染后小鼠血清 IgG、IgG1、IgG3和IgE水平与免疫前相比均明显增加(P＜0.05),而感染后小鼠血清IgG3和IgE水平与免疫后相比明显升高(F=24.59、49.84,P＜0.05);与免疫前相比,小鼠血清IgG2b在感染后明显降低(F=7.09,P＜0.05),感染后小鼠血清IgG2b水平与免疫后相比明显降低(P＜0.05);与免疫前相比,小鼠血清IgG2a在免疫后和感染后无明显变化(F=0.74,P＞0.05,表1)。

表1 rEgmyophilin免疫前、后和攻击感染后小鼠血清抗体检测( ,n=8)Table 1 Detection on immunoglobulin in sera of mice vaccinated with rEgmyophilin after challenge infection(,n=8)

表1 rEgmyophilin免疫前、后和攻击感染后小鼠血清抗体检测( ,n=8)Table 1 Detection on immunoglobulin in sera of mice vaccinated with rEgmyophilin after challenge infection(,n=8)

注:与免疫前比较,*P＜0.05;与免疫后比较,△P＜0.05

组别 免疫前(0w) 免疫后(8w) 感染后(20w) F P IgG 0.0220±0.0163 1.1369±0.0254* 1.5250±0.1451*△ 1456.48 0.000 IgG1 0.2149±0.0095 1.3061±0.1516* 1.4994±0.9128* 6.99 0.003 IgG3 0.0914±0.0155 0.0951±0.0175 0.3731±0.0166*△ 24.59 0.000 IgG2a 0.1140±0.0353 0.3286±0.6591 0.5043±0.7894 0.74 0.395 IgG2b 0.1543±0.0167 0.2057±0.1140 0.0627±0.0395*△ 7.09 0.001 IgE 0.0247±0.0006 0.0682±0.0103* 0.0891±0.0228*△ 49.84 0.000

3 讨 论

寄生虫的体液免疫方面,众多学者研究的比较多的是 IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 及 IgE 等。AI-Qaoud等〔8〕用抗原 B(EgAgB)免疫 Balb/c小鼠,其减蚴率为98.3%,且从免疫后的1月直到实验结束(7月)所有IgG亚型都是逐渐升高的。B抗原是较好的诊断抗原,是与包虫病免疫逃逸机制有关的抗原,在感染Eg的羊和小鼠体内,宿主的IgG和包囊壁相结合,构成宿主免疫屏障来完成免疫逃逸,因此,体液免疫指标可提高对CE的诊断效率及反映免疫逃逸的机制。Woollard等〔9〕将4种Eg95合成肽加用或不用弗氏佐剂肌肉注射免疫6～12月龄绵羊2次后发现第1次免疫后 3周羊血清抗Eg95的IgG2水平升高,持续1年以上,该抗体在体外可杀伤Eg虫卵的六钩蚴,提示IgG抗体参与了Eg95诱导的保护性免疫,并且认为保护力主要是由抗体介导的。林勇等〔10〕将 100μ g的 pCD-Eg95皮下注射Balb/c小鼠5次,在免疫后4～10w发现鼠血清 IgG升高,在免疫后 2～10w发现鼠血清IgG2a增加;丁剑冰等〔11〕将 50μ g Eg95 重组蛋白加弗氏佐剂皮下注射免疫Balb/c小鼠4次后发现第1次免疫后2w抗Eg95的IgG升高,且免疫后6～8w达最高水平,滴度可达1∶25 600。目前的研究结果显示用活的虫卵或者六钩蚴免疫小鼠主要产生IgG1和IgG3亚型〔12〕。本实验将 rEgmyophilin免疫小鼠,原头蚴攻击后发现小鼠血清IgG、IgG1、IgG3和IgE在免疫后以及感染后显著增加;IgG2a水平增加不明显,IgG2b水平先增加后降低,表明rEgmyophilin能够诱导小鼠产生很强的体液免疫反应,提示 IgG、IgG1、IgG2b和 IgE抗体在抗包虫感染过程中可能起重要作用,其保护性免疫机制有待于进一步深入研究。

程宁等〔12〕用1mg的Eg囊液抗原和原头节抗原加弗氏佐剂分别皮下注射免疫昆明种小鼠3次,首次免疫后4周用4000个Eg原头节进行攻击感染,感染后28w剖杀各组小鼠发现Eg囊液抗原组和原头节抗原免疫组的减蚴率分别为51.70%和77.10%,证明免疫的方法可以用于防止包虫蚴虫的感染。据此本实验在成功制备大量纯化 rEgmyophilin蛋白的基础上,用该重组蛋白免疫ICR小鼠,相对于佐剂对照组可获得94.46%的免疫保护力,免疫小鼠后可诱导产生较高的抗体水平,初步认为rEgmyophilin作为疫苗候选抗原具有一定的潜在价值。

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