日本血吸虫TβRII样基因胞外段的克隆、表达及初步鉴定*

陈 姗,马长玲,高志岩,麦璟莹,赵晶晶,朱郇悯,李小敏,李 孜

转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)超家族成员在细胞的生长、分化、细胞外基质的形成和免疫调节等方面都发挥着重要作用〔1-8〕。TβR(TGF-β受 体)有多 种,其 中 I 型(TβRI)、II型(TβRII)、III型(TβRIII)分布于多类细胞膜上。TβRI和 TβRII在 TGF-β信号转导中起主导作用,TβRII具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在生理浓度下可单独与 TGF-β结合,结合后TβRII胞内段结构发生改变,再与 TβRI结合形成 TGF-β-TβRII-TβRI复合体,随之 TβRI胞内段发生磷酸化,引起下游smad蛋白家族的一系列变化,从而将信号传递于细胞胞核内〔9-10〕,调控目的基因表达。

Osman等在曼氏血吸虫发现了 TβRII(SmTβRII),该基因大约为26kb,由9个外显子组成。序列比对表明,SmTβRII与哺乳动物(大鼠,小鼠,人)活性TβRII有一定的同源性。应用siRNA技术,沉默SmTβRII,可引起抱雌沟蛋白(Gynecophoral canal protein,GCP)表达减少,表明SmTβRII通过激活 TGF-β信号通路诱导GCP表达,提示TGF-β信号通路在雄虫促雌虫发育成熟方面起着重要作用〔11〕。在此基础上我们推测日本血吸虫亦有可能存在 TβRII(SjTβRII),在虫体自身发育和对宿主致病过程中发挥重要作用。本文通过RACE方法,获得日本血吸虫 TβRII样基因全长cDNA序列,在生物信息学分析的基础上,克隆、原核表达其N端(即胞外段),为进一步研究其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 E.coil BL21(DE3)菌种、原核表达载体pET28a(+)质粒均由本教研室保存,pMD19-T Vector购自TaKaRa公司。

1.1.2 实验动物和钉螺 新西兰大白兔购自广东省实验动物中心,阳性钉螺(Oncomelaniahupensis)购自江西省血吸虫病防治研究所。

1.1.3 主要试剂 T RIzol试剂购自Invitrogen公司,Taq DNA聚合酶、RT-PCR试剂盒、Marker DL2000、限制性内切酶、T4连接酶、蛋白质低分子量标准均购自TaKaRa公司;质粒小量抽提试剂盒及DNA胶回收纯化试剂盒购自美国Axygen公司,His·Tag融合蛋白纯化试剂盒购自QIAGEN公司,HRP标记的山羊抗大鼠二抗购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 日本血吸虫成虫总RNA的提取 按常规方法〔12〕尾蚴感染新西兰大白兔,45d后剖杀,收集成虫,抽提总RNA并测定其浓度、纯度。置-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计 Sj TβRII样基因cDNA全长序列由英潍捷基生物技术有限公司(Invitrogen)应用RACE方法获得。根据所获得的序列,设计扩增其全长的特异性引物,引物 1:GTCGAGCTCATGGAATGCTAT TGTACACC,含 Sac I酶切位点,引物2:GCCAAGCT TTGATCACTGAAAGTTAGGTA,含 Hind III酶切位点。扩增SjTβRII样基因胞外段的引物:上游引物同引物1,引物3:CGGAAGCT TGAT TAT TGGAGCTGT TATTA ,含Hind III酶切位点,以上引物均由Invitrogen公司合成。

1.2.3 Sj TβRII样基因的 RT-PCR扩增、TA克隆及序列测定 将日本血吸虫成虫RNA逆转录,以此反转录产物cDNA为模板,用扩增其全长的特异性引物进行PCR:94℃预变性5 min后,热循环参数为94℃45 s,61℃45 s,72℃2 min,共30个循环,最后72℃延伸10 min。纯化后的PCR产物按pMD19-T Vector试剂盒说明书,克隆入载体pMD19-T并转化大肠杆菌,挑取阳性克隆,进行PCR、双酶切和测序鉴定。通过在线 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库,跨膜结构分析工具TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)、SOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)对所获得的cDNA序列及其氨基酸序列进行综合分析。

1.2.4 Sj TβRII样基因胞外段(Sj TβRII-like-N)的原核表达、蛋白纯化 以成功构建的SjTβRII样基因的 TA克隆质粒为模板,以引物1、3行PCR,定向克隆入pET28a(+),对筛选的克隆进行PCR、双酶切和测序鉴定。阳性克隆菌经IPTG诱导5h后收集菌液,按常规方法行SDS-PAGE电泳分析〔13〕。

按上述方法对重组菌进行大量诱导表达,收集包涵体沉淀,用8 mol/L的尿素溶解变性后,离心收集上清。将上清过Ni离子亲和层析柱,用含1 mol/L咪唑的洗脱液洗脱并收集。纯化的蛋白透析之后取少量样品进行SDS-PAGE分析,并测定浓度。

1.2.5 SjTβRII样基因胞外段蛋白多克隆抗体的制备及其效价的测定 按常规方法〔14〕将纯化的目的蛋白免疫SD大鼠(200 μ g/只)。第1次免疫前采大鼠血并分离血清作为正常大鼠血清,末次免疫后10 d采血分离血清,以免疫前的大鼠血清作为阴性对照,ELISA法测定免疫大鼠血清抗体效价。

1.2.6 Western blotting鉴定 SjTβRII样基因胞外段蛋白 取纯化的重组蛋白,进行SDS-PAGE,电泳结束后电转移至硝酸纤维素(NC)膜,用免疫Sj TβRII样基因胞外段蛋白大鼠血清识别(按1∶2 500稀释),同时以免疫前的正常大鼠血清(按1∶2 500稀释)为阴性对照,以HRP标记的山羊抗大鼠IgG抗体作为第二抗体(按1∶5 000稀释),进行Western blotting 分析〔13〕。

2 结 果

2.1 日本血吸虫Sj TβRII样基因的 RT-PCR扩增、TA克隆及鉴定 应用引物1、2,以成虫总 RNA为模板,经RT-PCR扩增获得约2 300bp特异条带,与预期分子量大小一致。将构建的TA克隆重组质粒经PCR鉴定,与目的基因条带相符,测序结果表明该序列与Invitrogen公司应用 RACE方法获得的SjTβRII样基因cDNA序列完全一致。此序列已获得NCBI登录号:FJ753578。

2.2 Sj TβRII样基因的生物信息学分析SjTβRII样基因cDNA 全长2283 bp,编码760个氨基酸,蛋白的理论分子量为86.488 kDa,等电点为6.47。经软件分析其aa259-aa559具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,确定aa1-aa144氨基酸位于胞外段,aa144-aa157氨基酸位于跨膜段,aa157-aa760氨基酸位于胞内段,不含有信号肽序列。

同源性分析发现Sj TβRII样基因氨基酸序列与曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni,S.m)TβRII(GenBank登录号:AAV67030.1)、多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,E.m)TβRII(Gen-Bank登录号:CAQ76822.1)、红原鸡(Gallus gallus,G.g)TβRII(GenBank登录号:NP_990759.1)、黑猩猩(Pan troglodytes,P.t)TβRII(GenBank登录号:XP_001166647.1)、小鼠(Mus musculus,M.m)TβRII(GenBank 登录号:AAH52629.1)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata,T.g)TβRII(GenBank登录号:XP_002195667.1)、人(Homo sapiens,H.s)TβRII(GenBank登录号 :AAA61164.1)、斑马鱼(Danio rerio,D.r)TβRII(GenBank 登 录 号:AAI65315.1)的氨基酸序列一致性分别是70.7%、28.6%、18.4%、18.3%、18.1%、17.9%、17.9%、17.8%。因为尚未对所获得的基因做功能研究,故暂命名为Sj TβRII样基因。

应用Vector NTI软件对9个物种 TβRII的氨基酸序列进行分子进化树的构建,见图1,结果显示日本血吸虫SjTβRII样基因和曼氏血吸虫TβRII源于同一祖先,与人、鼠的进化关系最远。

图1 日本血吸虫T βRII样基因与其它物种T βRII的分子进化分析Fig.1 Phylogenetic analyses SjT β RII-like gene with T β RII from other species

2.3 SjTβRII样基因胞外段克隆及蛋白表达、纯化将构建的原核表达重组质粒分别经PCR、双酶切鉴定,均出现与目的基因相符的条带,同时测序结果亦表明重组质粒构建成功。经重组质粒转化的工程菌经IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE显示分子量约在22 kDa处出现一明显蛋白条带,而空质粒转化菌在诱导前后以及重组质粒工程菌在诱导前均无此蛋白条带的出现,表明此蛋白条带为目的蛋白条带,见图2。菌体裂解上清中未见该蛋白条带的出现,提示该蛋白主要以包涵体形式表达。经8 mol/L尿素变性溶解后,将溶解上清经过Ni离子亲和层析柱,在不同低浓度咪唑梯度漂洗后,用1 mol/L咪唑洗脱,获得分子量约22kDa的较单一蛋白。

图2 SjT βRII样基因胞外段原核表达及纯化产物的SDSPAGE鉴定1.未诱导的含空载体 pET28a(+)的菌体蛋白;2.诱导的含空载体pET28a(+)的菌体蛋白;3.未诱导的含重组质粒pET28a-SjTβ RII-like-N的菌体蛋白;4.诱导的含重组质粒的菌体蛋白;M,蛋白质分子量标准物;5.纯化后的目的蛋白Fig.2 Expression and purification of SjTβRII-like-N1,BL21 cell containing pET-28a(+)without IPTG induction;2,BL21 cell containing pET28a(+)with IPTG induction;3,BL21 cell containing pET28a-SjTβ RII-like-N without IPTG induction;4,BL21 cell containing pET28a-SjTβ RII-like-N with IPTG induction;M,protein molecular marker(masses shown on the right side);5,pET28a-SjTβRII-like-N recombinant proteins purified by the affinity purification method

2.4 Western-blotting鉴定SjTβRII样基因胞外段重组蛋白 用ELISA方法测定免疫SjTβRII样基因胞外段重组蛋白大鼠血清效价约为1∶10 000。免疫重组蛋白的大鼠血清对纯化蛋白的 Western Blotting显示出清晰的条带,阴性对照未见条带(图3)。

3 讨 论

大量实验已证实 TβRI和TβRII在 TGF-β信号转导中起主导作用。在抗 TGF-β的生长抑制作用的MvlLu突变细胞系研究发现,没有 TβRII,TβRI不能结合 TGF-β;没有 TβRI时 ,TβRII则不能传递TGF-β的信号〔9-10〕。日本血吸虫对宿主的致病主要是其引起的肝脏虫卵肉芽肿及其纤维化病变,而 TGF-β1是目前公认的最强的肝纤维化促进因子之一〔15〕,因此获得 SjTβRII基因序列是研究虫体TβR所介导的TGF-β的信号传导通路在日本血吸虫致病方面的基础。另外,鉴于曼氏血吸虫的TβRII可诱导抱雌沟蛋白GCP表达,从而在雄虫促雌虫发育成熟方面所起的重要作用〔11〕,提示TβRII可作为疫苗候选分子。

图3 SjTβRII样基因胞外段纯化产物被该蛋白免疫的大鼠血清识别M:蛋白质分子量标准物;1:免疫大鼠血清;2:免疫前大鼠血清Fig.3 Purification of pET28a-SjT βRII-like-N recognized by antisera of SD ratM:protein mark;1:the purified product of pET28a-SjTβRII-like N reacted with immune serum of SD rat;2:the purified product of pET28a-SjTβ RII-like-N reacted with normal serum of SD rat.

通过RACE方法,本文首次获得了日本血吸虫TβRII样基因全长cDNA序列,通过生物信息学分析,其 cDNA 全长2 283bp,编码 760个氨基酸,具有TβRII保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点。序列比对发现其与曼氏血吸虫TβRII氨基酸序列高度同源,而与宿主小鼠、人的TβRII氨基酸等同源性低,尤其是胞外段氨基酸序列,与小鼠和人的相应序列一致性仅为8.5%,因此,本实验克隆、原核表达日本血吸虫TβRII样基因胞外段,以进一步研究其是否可作为日本血吸虫疫苗的靶分子。

本文成功构建了日本血吸虫的TβRII样基因胞外段原核表达载体,并获得了高效表达,但表达产物以包涵体的形式存在,经变性处理后的亲和层析纯化,可得到较纯的重组蛋白。免疫大鼠可获得高效价的免疫血清,Western blotting结果表明该蛋白具有较强的线性表位,上述实验结果为研究Sj TβRII样基因的生物学功能奠定了基础。

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