高速逆流色谱法分离纯化白鲜皮中梣酮的初步研究

张红晶，王 琦，时东方，赵立春，王 晶，吴桂梅，刘春明*

（1. 吉林农业大学，吉林 长春 130118；2. 长春师范学院，吉林 长春 130032； 3. 河北大学 药学院，河北 保定 071002）

高效离心分配色谱（HPCPC）技术是高速逆流色谱技术的一种，是利用溶质在两种互不相溶的溶剂系统中分配系数的不同，从而实现分离的色谱技术。高速逆流色谱法不需要对样品进行复杂处理，与传统柱层析法相比，它具有分离速度快、样品吸附低、分离重现性好、不会吸附、污染、损失样品等优点[1]。根据紫外吸收色谱图可良好重复收集样品，若与制备液相色谱结合，则可快速、大量的制得相应纯度的标准品[2]。高速逆流色谱在生物碱、黄酮、酚类、醌类、苷类、脂肪酸、多肽等化合物分离中得到广泛应用[3～4]。

白鲜皮为芸香科白鲜属植物白鲜（Dictamnus dasycarpus）和狭叶白鲜（D. angus tifolius）的干燥根皮，具有祛风、燥湿、解毒等功效[5]。近年来的研究表明，白鲜皮中的化学成分主要有两类：生物碱类和内酯类，其中梣酮（fraxinellone）作为新型的肝病治疗药物，具有良好的保肝降酶及抑制肝纤维化等活性，并具有抑菌、杀虫等活性[6]。目前，梣酮的药理作用已成为国内外专家学者研究的热点，分离制备梣酮单体对进一步开发新的天然药物具有十分重要的意义。本文采用HPCPC分离、纯化、制备中药白鲜皮活性成分梣酮，为制备白鲜皮有效成分的化学对照品提供了一种简捷实用的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白鲜皮，购于北京同仁堂药店（长春分店）；梣酮标准品（中国药品生物制品检定所）；正己烷、乙酸乙酯、无水乙醇、甲醇、正丁醇及乙醇（分析纯，北京化工厂）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；超纯水（18.2ΩPa）。

1.2 仪器与设备

HPCPC-80型高效离心分配色谱仪（日本），检测器为UV检测器；Waters 2695-2998型高效液相色谱仪（美国），PDA检测器，C18色谱柱（150×4.6 mm，5μm）和C18保护柱；S180H超声波提取仪（德国Elma公司）；BS-124S型电子天平（Sartorius德国）；HS-Z11-Ⅱ电热蒸馏水器（上海跃进医疗器械厂）；纯水器（法国Milli Q公司）。

1.3 白鲜皮粗提物的制备

白鲜皮粉碎后精确称取50 g，用85%乙醇溶液，料液比1：20，在80℃水浴中提取2次，每次提取1 h，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩回收乙醇，浓缩液置真空干燥箱中干燥保存备用。

1.4 高速逆流色谱

1.4.1 溶剂系统选择 应用高速逆流色谱仪分离样品时，溶剂系统的选择是最关键的问题。选择溶剂系统一般遵循以下原则：①形成稳定的两相溶剂体系，沉降时间小于30 s，保留率大于50%；②不造成样品的分解与变性，避免选择毒性大的溶剂；③样品在系统中有合适的分配系数，一般在0.5 ～ 2.0[7]。选用正丁醇-乙酸乙酯-水、正丁醇-乙酸乙酯-乙醇-水、正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水3个系统作为分离梣酮的溶剂系统。

1.4.2 沉降时间的测定方法 在10 mL刻度试管中按溶剂系统的比例加入混合溶剂，充分振荡后静置，分层的时间记为沉降时间。

1.4.3 分配系数K的测定方法 在10 mL试管中按照选定的比例分别加入各种溶剂，充分振摇，静置分层，分取上、下层溶液各1 mL，加入少量白鲜皮乙醇提取物，再经过充分振荡，静置分层，然后分别取上下层溶液各500μL，过 0.45μm微孔滤膜，利用高效液相色谱法测定溶剂体系上、下相所含样品的浓度，以下相中组分峰面积与上相中组分峰面积的比来求得样品中各类成分在该溶剂系统中的分配系数（K）。流动相为甲醇：水 = 58：42（V/V），柱温25℃，流速为0.80 mL/min，检测波长228 nm。

1.4.4 HPCPC分离 将按比例配置的溶剂系统在分液漏斗中混合，充分振荡，静置约20 min，分离后超声脱气20 min。将上相（固定相）以3.0 mL/min的流速泵入并确定充满分离螺线管后暂停泵的工作，同时按选定的转速启动主机、开启检测器，以228 nm波长进行检测。等待主机转动稳定后将下相(流动相)以选定的流速泵入，待流动相从管柱出口流出且基线稳定后将样品溶液由进样圈注入（样品为白鲜皮乙醇提取物分别用1 mL溶剂系统的上下层溶解）。管柱出口处的流出物经紫外检测器检测，将各峰对应的收集液分别浓缩，待测。

1.5 HPLC纯度检测 对白鲜皮样品和经HPCPC分离纯化所收集的纯化液进行HPLC图谱分析。液相条件如下：流动相为甲醇：水 = 58：42（V/V），柱温25℃，流速0.8 mL/min，检测波长228 nm；色谱柱为：SunFireTMC18（4.6×150 mm，5μm）；进样量为10μL。

表1 不同溶剂体系的分配系数比较Table 1 Comparison among isolation parameters of different solvent systems

2 结果与分析

2.1 HPCPC溶剂系统的选择结果

由表1可以看出，梣酮在溶剂系统1和2中的分配系数远大于5，而系统3和4的分配系数远小于1，都不适合；结合实际上机实验结果分析，我们选择HPCPC溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（1:1:1:1，V/V），进行对白鲜皮中梣酮的分离。

2.2 HPCPC分离结果

白鲜皮粗提物的高速逆流色谱分离图谱见图1。由图1可见，在本实验条件下经HPCPC分离纯化150 min后，得到2个较明显的峰。分别收集这2个峰，经浓缩干燥并采用HPLC对它们的纯度进行检测。

2.3 HPLC纯度分析结果

样品及各分离峰色谱图如图2、图3所示。经HPLC检测，用峰面积归一法测得峰2接收液纯度达到99%以上。

图1 白鲜皮粗提物的高速逆流色谱分离图Figure 1 HPCPC of extract from D. dasycarpus

图2 白鲜皮样品HPLC色谱图Figure 2 HPLC chromatogram of extract from D. dasycarpus

图3 分离得2号峰接收液HPLC色谱图Figure 3 HPLC chromatogram of fraction No.2 obtained by HPCPC

图4 梣酮标准品HPLC色谱图Figure 4 HPLC chromatogram of standard Fraxinellone

3 结论

本实验应用高速逆流色谱法对白鲜皮粗提物进行了分离纯化，在溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（1:1:1:1，V/V）时分离得到一个单体化合物和两个混合物组分（分别占 40%和 60%）。通过与标准品及已知文献[8]对比，初步确定峰2为单体化合物梣酮，按照HPLC色谱峰面积计算，其含量高于99%。应用HPCPC 分离白鲜皮中的化学成分，由于不用固态载体作固定相，避免了载体填充所形成的不可逆吸附，减少了样品的损耗，具有简便、快速、分离效率高等特点，对于有效的分离纯化内酯类物质具有较好的实际应用价值；另外，样品可以作为标准品用于药物分析或药理与毒理实验，为梣酮的进一步定性和结构鉴定提供一定的帮助。

[1] 张天佑. 逆流色谱技术[M]. 北京：北京科学技术出版社，2001. 171.

[2] 戴德舜，王义明，罗国安. 高速逆流色谱研究进展[J]. 分析化学，2001，29（8）：586－591.

[3] 祝顺琴，谈锋. 高速逆流色谱在天然产物分离中的应用[J]. 中国医药工业杂志，2005，36（12）：788－791.

[4] 陈爱华，杨坚. 高速逆流色谱（HSCCC）在食品色素制备中的应用[J]. 中国食品添加剂，2005（1）：83－85.

[5] 中国药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京：化学工业出版社，2005.

[6] 徐强，吴斐华，朱丹妮. 梣酮作为肝病治疗药物的应用[P]. 中国：CN2005-1004087 8.2005.

[7] 李艳，肖凯军，郭祀远，等. 高效逆流色谱研究进展—在天然产物有效成分分离方面的应用[J]. 现代食品与药品杂志，2006，16（4）：78－80.

[8] 肖培根. 新编中药志[M]. 北京：化学工业出版社，2002. 554－555.