藻蓝蛋白对2型糖尿病大鼠胰岛细胞 NFκB和 IκB表达的影响*

张 蕊，马 璇，刘 琳，刘吉东，沈 卫

近年来倍受关注的炎症病因学理论认为，2型糖尿病是一种自然免疫和低度炎症性疾病，细胞因子是导致代谢综合征的主要原因，而炎症是胰岛素抵抗的触发因素[1]。甚至在亚临床阶段，慢性炎症就参与了胰岛素抵抗综合征的发生。在整个炎症网络中，核因子 κB（NFκB）是研究的热点。NFкB 抑制蛋白（IкB）激酶（IKK）／NFκB 炎症通路活化是导致胰岛素抵抗和糖尿病的重要机制之一[2-3]。但对于该通路在胰岛细胞中活性变化的研究，国内鲜有报道。藻蓝蛋白是螺旋藻中的一种重要活性物质，大量文献报道其能够抗炎和调节免疫。初步体外实验表明，藻蓝蛋白具有抗2糖尿病的作用。为此，本实验建立2型糖尿病大鼠模型，应用藻蓝蛋白进行干预，研究其对胰岛细胞功能的影响和IкB／NFκB通路活性变化的机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型 健康雄性Wistar大鼠32只，鼠龄1个月，体质量130 g~150 g，由青岛市药检所实验动物中心提供（SCXK（鲁）20030010）。动物均于实验前置于实验室适应环境1周，自由饮食，室温（23±2）℃，自然光照，相对湿度50%~70%。1周后，24只大鼠以高糖高脂饲料（15%猪油、20%蔗糖、13%蛋黄粉、2%胆酸钠、50%普通饲料）喂养，其余8只喂以普通饲料。4周后禁食12 h，高糖高脂组以30 mg/kg剂量1次性腹腔注射1%链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）柠檬酸缓冲液，普通饲料组同步注射等量的柠檬酸缓冲液。3周后剪尾取血，测空腹血糖，以血糖值≥7.0 mmol/L为糖尿病模型建立成功，24只大鼠全部造模成功。将24只造模成功的大鼠随机分为糖尿病模型组、藻蓝蛋白组、二甲双胍组，每组8只，其中模型组2只大鼠于实验第11周死亡。

1.2 干预措施 实验第9周开始干预治疗。藻蓝蛋白粉剂（由中国科学院海洋研究所提供）暗室分装后-20℃保存，用前加蒸馏水稀释至浓度为10%的混悬液，按500 mg/kg体质量灌胃给药（藻蓝蛋白剂量由中国科学院海洋研究所推荐使用），1次/d，连续10 d；二甲双胍组同步给予蒸馏水稀释至8%浓度的二甲双胍，以400 mg/kg连续灌胃10 d。糖尿病模型组同步给予等体积的生理盐水，连续灌胃10d。

1.3 标本采集及处理 治疗结束后(11周初)，各组大鼠颈椎脱臼处死，迅速取胰腺，4℃生理盐水冲洗干净后10%甲醛固定24 h，蒸馏水浸泡4 h。常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，LEICA2135石蜡切片机连续切片，厚度5 μm，每隔20片取1片，每个标本取6片，分别裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，室温保存备用。

1.3.1 血糖 各组动物分别在第造模前、造模后、治疗后测空腹血糖（FBG）（mmol/L）。测空腹血糖前夜，大鼠禁食12 h，次日鼠尾静脉取血，用自动血糖仪（强生医疗器材有限公司，稳豪型）测定空腹血糖。

1.3.2 免疫组化染色 NFκBp65和IκBα亲和纯化抗体、即用型SABC试剂盒、3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。取上述切片置于60℃烤箱烤片1 h，常规脱蜡至水，蒸馏水浸泡2 min，严格按试剂盒说明书操作，DAB显色，光镜下特异性染色为片状棕黄色颗粒。对每批染色均同步设立以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）液代替一抗的阴性空白对照。光学显微镜（400倍）下，每张切片计数100个胰岛细胞，分别记录其中的阳性细胞数。

2 结果

2.1 空腹血糖 STZ造模后，模型组、藻蓝蛋白组、二甲双胍组大鼠空腹血糖与正常组比较明显升高（P<0.05）。经干预治疗后，藻蓝蛋白组、二甲双胍组大鼠空腹血糖与模型组比较显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠空腹血糖的比较（s）

表1 各组大鼠空腹血糖的比较（s）

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

组别 n 剂量（mg/kg）正常组模型组藻蓝蛋白组二甲双胍组8888--500 400造模后（9周）血糖(mmol/L)3.48±0.50 9.15±3.20△9.75±1.58△9.20±0.36△治疗后(11周)血糖(mmol/L)3.91±0.71 8.94±1.90△7.05±0.87*5.74±1.32*

2.2 病理形态学 正常组大鼠胰岛为圆形或椭圆形着色淡浅的细胞团，分散于胰腺腺泡之间，数量较多、形状规则、界限清楚，胰岛内细胞排列整齐、大小一致、分布均匀，细胞核大而圆。模型组大鼠胰腺内胰岛细胞团数量减少、分布稀疏，残存胰岛萎缩、边缘皱缩、界限不清，胰岛细胞数目减少、空泡增多，部分细胞发生融合、核溶解、聚集边靠、有的细胞核缺失，只残留伊红浅染的细胞质。藻蓝蛋白组和二甲双胍组大鼠胰岛细胞病变减轻，胰岛细胞团形状较规则，与模型组有较大改善，但与正常组相比仍有差距，见图1。

2.3 NFκB的表达 观察各组大鼠胰岛细胞核中NFκB的染色情况。正常组大鼠只局部胰岛细胞核有着色；糖尿病模型组大鼠胰岛细胞核NFκB表达显著增强（P<0.05），细胞核呈明显棕黄色；藻蓝蛋白和二甲双胍干预组大鼠胰岛细胞核NFκB的表达较糖尿病模型组均明显降低（P<0.05），细胞核呈淡黄色。藻蓝蛋白组与二甲双胍组比较，无显著性差异（P＞0.05），见表 2、图 2。

图1 各组大鼠胰岛细胞形态和结构，HE×400

表2 各组大鼠NFκB和IκB表达的比较（s）个

表2 各组大鼠NFκB和IκB表达的比较（s）个

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

分组正常组模型组藻蓝蛋白组二甲双胍组n8688 NFκB 10.75±3.62 53.83±6.52△22.13±6.90△*21.50±4.93△*IκB 74.88±8.95 30.67±6.53△42.88±7.68△*43.25±6.69△*

图2 各组大鼠胰岛细胞NFκB的表达，SABC×400

2.4 IκB的表达 观察各组大鼠胰岛细胞浆中IκB的染色情况。正常组大鼠胰岛细胞浆呈明显棕黄色；糖尿病模型组大鼠胰岛细胞浆中IκB表达显著降低（P<0.05），只局部细胞有着色；藻蓝蛋白和二甲双胍干预组大鼠胰岛细胞浆IκB的表达较糖尿病模型组均明显提高（P<0.05）。藻蓝蛋白组与二甲双胍组比较，无显著性差异（P＞0.05）（图 3）。

图3 各组大鼠胰岛细胞IκB的表达，SABC×400

3 讨论

3.1 藻蓝蛋白对糖尿病大鼠胰腺中IкB/NFκB通路的影响 NFκB是一种对众多炎症因子的转录具有调控作用的蛋白质分子。静息状态时，NFκB与其抑制蛋白IкB结合，以无活性的形式定位于细胞浆之中。高血糖、高游离脂肪酸、糖基化终末产物、感染等因素导致机体氧化应激增强，激活IкB激酶（IKK）。活化后的IKK使IкB降解从而与NFκB分离，NFκB移位进入细胞核中，与DNA链上特异部位结合，启动基因转录[4]。多种炎症因子和炎症酶靶基因的转录，如 TNFα、IL2、IL18、NOS、COX-2 等，使得这些炎症因子和酶过度表达，造成胰岛炎性浸润，胰岛β细胞功能障碍和糖尿病及其并发症的产生。大量文献表明NFκB与糖尿病肾病和大血管并发症的发生密切相关[5-7]。用NFκB的活性抑制剂吡咯烷二硫基甲酸酯（PDTC）抑制其活性能延缓糖尿病肾病的发展[8]。大鼠胰腺是STZ毒性损伤的靶器官，STZ可以通过一氧化氮和自由基等途径损伤胰岛β细胞诱发糖尿病，而自由基是激活NFκB的因素之一。由此推测，糖尿病大鼠胰腺中有IкB/NFκB通路的活化。

实验NFκB免疫组化结果可见，正常组大鼠胰岛细胞团中胰岛细胞浆呈明显棕黄色着色，只局部胰岛细胞核有着色，而糖尿病大鼠胰岛细胞团中胰岛细胞核呈明显棕黄色着色，细胞浆几乎不着色。IκB的免疫组化结果显示，正常组大鼠胰岛细胞浆呈深棕黄色着色，细胞核几乎不着色，而糖尿病组大鼠胰岛细胞核、浆几乎都不着色。这体现了糖尿病大鼠胰岛细胞中IκB被降解后，激活的NFкB从细胞浆到细胞核的转移过程。藻蓝蛋白干预组大鼠胰岛细胞核NFκB表达较糖尿病组明显减轻，而IκB表达增强，说明干预后IκB的活性可能有所恢复，NFκB在胰岛细胞核中的表达降低。提示藻蓝蛋白可能具有抑制IкB/NFκB通路活化的作用。

3.2 藻蓝蛋白对糖尿病胰腺的保护作用 藻蓝蛋白是螺旋藻细胞中重要的光合作用天然色素，在螺旋藻中的含量高达10%～20%。近年来国内外人员研究表明,藻蓝蛋白具有抗疲劳、抗辐射、抑制肿瘤、降低血脂、调节免疫、抗炎等多种功能且安全无毒。Romay等[9-10]第一次报道了藻蓝蛋白具有抗炎、清除氧自由基的作用,他们研究证明藻蓝蛋白在12种炎症实验模型中表现出抗炎效应。藻蓝蛋白可以清除烷基、羟基、过氧基,可以抑制由亚铁离子（Fe2+）、坏血酸致微粒体脂质过氧化，其抗氧化作用与抑制肿瘤坏死因子 α（TNFα）及一氧化碳（NO）产生有关[9]。二甲双胍是应用多年的抗2型糖尿病一线药物，它可以抑制高糖所诱发的炎症反应[11]，通过抑制NFκB的活化而减弱ILβ/TNFα诱导的培养皿中血管壁细胞（EC、单核细胞等）炎症细胞因子的表达，提示其具有直接的抗炎作用。但临床上长期应用二甲双胍会造成一定的毒副作用。本实验观察到藻蓝蛋白有类似二甲双胍的作用，可明显抑制糖尿病大鼠胰岛细胞中有IкB/NFκB通路的活性，具有一定的胰岛细胞保护作用，其机制可能为：减少IKK激活导致的IκB磷酸化和降解，抑制NFκB介导的基因转录，降低TNFα、IL2、IL6等炎症因子的表达和NOS催化的NO表达从而减少胰岛细胞炎症；降低血脂，减轻脂质过氧化，清除各种自由基，保护胰岛细胞。藻蓝蛋白可以显著降低糖尿病大鼠的血糖，降低血糖的程度不如二甲双胍，可能因为：藻蓝蛋白具有独立的、不依赖于降糖作用的抗炎、抗氧化应激机制，藻蓝蛋白的降糖作用更为缓和，故在干预期间降糖效果不如二甲双胍。

综上所述，藻蓝蛋白表现出抗2型糖尿病的药理作用且无毒副作用，因此可能成为今后新型的治疗2型糖尿病的药物或功能性食品。

参考文章：

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