野马追对急性油酸性肺损伤大鼠肺血管通透性的影响

杨 辉，周远大，何海霞

（1.重庆医科大学附属第一医院药剂科，重庆 400016；2.重庆医科大学附属第一医院临床药理教研室，重庆 400016）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是心源性以外的各种肺内外致病因素引起的弥漫性肺泡-毛细血管膜炎症性损伤，严重的ALI被定义为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。ALI的主要机制在于微血管通透性增高引起的蛋白泄漏、中性粒细胞聚集和促炎性介质的表达，目前尚无非常有效的药物。野马追盛产于江苏、安徽等地山区，其他各省也有分布，药源丰富。野马追具有明显的镇咳、平喘和祛痰作用[1]，对大鼠急性肺损伤具有明显的保护作用[2]。本试验研究了野马追对急性油酸性肺损伤大鼠肺血管通透性的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与试药

健康合格清洁级Wistar大鼠72只，雌雄各半，体重220～280 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。油酸（苏州工业园区正兴化工研究院）；野马追提取液，棕黑色液体，味苦涩，每1 mL原液含1.28 g药材，江苏安格药业有限公司，批号为003086，密闭放置于4℃冰箱中保存，试验前先用煮沸法将其浓缩配制成每1 mL含2.56 g生药的野马追提取液，临用时再用生理盐水配成所需质量浓度；伊文思蓝（EBD，上海科兴生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 动物模型的建立、分组及给药方法

将动物随机分为空白对照组（A组），模型对照组（B组），地塞米松组（C组），野马追大剂量组（D1组）、中剂量组（D2组）和小剂量组（D3组），每组12只。除A组外的其余各组动物分别静脉注射以0.1%牛血清白蛋白（BSA）振荡混匀的油酸0.1 mL/kg，A组静脉注射等容量的BSA，造成肺损伤模型，造模6 h后采集相关试验样本。D1组、D2组、D3组分别按 22，11，6 g/kg 剂量灌服野马追提取液[1]，给药容积为每100 g体重2 mL，A组、B组及C组灌服等容量的生理盐水，每日1次，连续14 d。于末次灌服药物后，C组予腹腔注射地塞米松2 mg/kg，其余各组给予相同容量的生理盐水腹腔注射。

1.2.2 病理学检查

各组任意取2只大鼠，切除右肺中叶（自肺门至肺边缘一段），用福尔马林固定后作形态学观察。

1.2.3 观察指标及测定方法

支气管-肺泡灌洗液（BALF）分析：各组取10只大鼠，分离气管，于环状软骨下方用手术刀片做倒T型切口（取材时避免血液进入气管，以免影响灌洗液的成分），将自制的塑料软管插入气管，用缝合线固定（避免漏气），分离心肺（不要触及肺脏以免影响灌洗），结扎右侧支气管。切除右肺中叶（自肺门至肺边缘一段），用作肺血管通透性测定。用注射器分别抽取3，2，2 mL生理盐水，缓慢注入左肺中再缓慢吸出，连续3次，总量为5 mL，要求回收率大于75%（必要时用纱布轻柔挤压肺组织）。取BALF，将离心后沉降的细胞用 500 μL磷酸盐缓冲液（PBS）重新悬起，取 100 μL细胞悬液用细胞计数板计数细胞。采用Lowry法[3]测定BALF中蛋白含量，计算肺通透指数。肺通透指数=BALF中蛋白含量/血浆蛋白含量。

肺血管通透性测定[4-5]：先描绘EBD的甲酰胺溶液的标准曲线。各组取10只大鼠，均在取样前15 min从尾静脉注射EBD 30 mg/kg，开胸取肺，以滤纸吸干表面水分，剪去周围组织，将肺浸泡于甲酰胺溶液中（甲酰胺用量为每100 g体重20 mL），置37℃温箱中温育72 h，取出肺组织，离心，取上清液，用UVmini 1240型紫外-可见分光光度仪进行比色，根据标准曲线计算每克肺组织中EBD含量，以反映肺血管通透性变化。

肺系数及肺含水量测定：试验结束后，取全肺称重，按如下公式计算肺系数。肺系数=双肺湿重/大鼠体重。同时取右肺固定部分称重，置烘箱（80℃，48 h）烘至恒重后，再次称重，计算肺含水量。肺含水量=（湿肺重-干肺重）/湿肺重×100%，判别水肿程度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况及病理学检查结果

试验前各组动物在静息状态下呼吸平稳，注射油酸后B组动物立即出现呼吸急促、烦躁，约20～30 min后出现呼吸窘迫，呼吸频率增加，紫绀；C组、D1组、D2组及D3组动物反应较轻；A组动物未见明显变化。裸眼下，B组动物肺体积增大；其余各组动物肺体积有所增大，但程度较轻。光镜下，B组动物肺表面可见广泛灶状出血，内皮受损，肺泡壁显著增厚，肺间质水肿，有大量红细胞、白细胞浸润和部分肺泡萎缩；除A组外其余各组充血、水肿表现较轻；A组未见充血、水肿表现。

2.2 观察指标测定结果

根据EBD含量（每100 mL肺组织中含EBD的质量）与吸光度A 建立回归方程，Y=3.158 0 X-0.041 6，r=0.996 1（n=6）。EBD含量-吸光度标准曲线见图1。各观察指标测定结果见表1。

图1 EBD含量-吸光度标准曲线

表1 各组观察指标测定结果（X ± s，n=10）

表1结果显示，急性肺损伤时，BALF中渗出细胞数量显著增加，地塞米松能使升高的BALF中渗出细胞数量明显降低，大、中剂量野马追提取液能有效阻止急性肺泡上皮损伤的炎性细胞渗出；BALF中蛋白含量显著增加，会导致肺通透指数变大，地塞米松能有效抑制肺通透指数增加，大、中剂量野马追提取液能有效防止急性肺泡上皮炎症损伤，降低肺泡的通透性；大、中剂量野马追提取液能剂量依耐性地降低急性油酸性肺损伤所致的肺血管通透性；肺含水量显著增加，地塞米松能有效防止急性肺损伤时所致的肺含水量增加，大剂量野马追提取液也有类似效应；肺系数变大，地塞米松能有效防止肺系数增加，大、中剂量野马追提取液也有类似效应。

3 讨论

油酸是一种毒性较强的饱和脂肪酸，主要通过氧化应激反应、促凝血活性增高以及内皮素作用等机制导致肺损伤，破坏肺泡上皮屏障；同时其对肺毛细血管内皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞等有直接毒性作用。本试验中，油酸致伤组大鼠表现为明显紫绀、呼吸急促或呼吸窘迫，严重低氧血症，结合病理观察显示肺间质充血、出血、炎症细胞浸润，肺间质和肺泡水肿及部分肺泡萎缩，表明大鼠油酸性肺损伤模型制备成功。

野马追为菊科泽兰属植物二叶尖佩兰，多年生草本，以全草入药，所含化学成分主要有黄酮类、生物碱类、挥发油和香豆精等。其味苦、性平，具有清肺、止咳、平喘和抗菌、抗病毒等功效，临床用于祛痰止咳、平喘抗炎等。野马追对大鼠急性肺损伤有明显的保护作用[2]。本试验结果显示，野马追能明显改善静脉注射油酸后所致的急性肺损伤症状，并能够降低BALF中细胞数量和蛋白含量，减轻肺水肿，降低肺系数，降低肺血管的通透性。肺血管通透性是维持肺间质和肺泡水分及溶质稳定的重要因素，ARDS就是以肺泡-毛细血管膜的高通透性为病理特征的ALI，此时液体和蛋白由血管腔进入间质间隙和肺泡，从而形成致命性肺水肿和呼吸衰竭[6]。因此，肺血管通透性升高是ARDS和ALI发病的重要机制，野马追对急性肺损伤的治疗作用可能部分是通过降低肺血管通透性实现的。

[1]周远大，吴 妍，朱深根，等.野马追抗菌、止咳、平喘作用[J].中国药房，2001，12（12）：716-718.

[2]江 舟，杨 辉，何海霞，等.野马追对大鼠急性肺损伤保护作用研究[J]. 中国药房，2007，18（27）：2 094-2 096.

[3]方福德，周 吕，丁 濂，等.现代医学实验技巧全书[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995:559-561.

[4]Severgnini M，Takahashi S，Tu P，et a1.Inhibition of the src and jak kinases protects against lipopolysaceharide-induced acute lung injury[J].Am J Respir Crit Care Med，2005，171（8）：858-864.

[5]朱瑞芳，周 敏，何建林，等.姜黄素对大鼠油酸型急性肺损伤的保护作用[J]. 中国中药杂志，2008，33（17）：2 141-2 145.

[6]秦开秀，简华刚.乌司他丁对小鼠内毒素性急性肺损伤的保护作用[J].中国药业，2006，15（18）：14-16.