如何快速鉴定临床标本中的粪肠球菌和屎肠球菌

黄蓉

肠球菌是医院感染常见菌，其中粪肠球菌约占80%～90%，其次是屎肠球菌，约占50%～15%[1]。产β-内酰胺酶的肠球菌及耐高浓度氨基糖甙类肠球菌，特别是耐万古霉素肠球菌的出现，给临床治疗带来极大的困难[2]。此2种肠球菌的耐药性差异性很大，快速准确地从临床标本中区分、鉴定2种肠球菌已迫在眉睫。荧光原位杂交法采用标记不同荧光素的2条探针，可在2h内在一张玻片上同时快速鉴定粪肠球菌和屎肠球菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1)标准参考菌株：所有标准菌株购自卫生部临床检验中心，见表1。其中肠球菌11株，链球菌3株，葡萄球菌2株，微球菌1株。2)寡核甙酸探针：检测粪肠球菌的ENF191探针5'端标记异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocy-anate, FITC)(绿色信号)，检测屎肠球菌的ENU14探针5'端标记Cy3(红色信号)，同时以通用探针EUB338和Non-EUB分别作阳性对照和阴性对照，探针由Euro Gentee BV(Maas-tricht，荷兰)合成，探针的序列见表l。

1.2 方法

1)肠球菌的鉴定：常规培养后，用法国生物梅里埃AP120 STREP系统鉴定。2)荧光原位杂交法：取临床标本涂片2张，一张用于革兰染色，若发现短链状排列的阳性球菌，将另一张先干燥固定，而后96%乙醇固定10min，空气干燥；以2mg/mL的溶菌酶(Sigma)37℃下处理玻片15～30min，蒸馏水洗涤后干燥(溶菌酶溶于10mmol/LTris，pH8.0的缓冲液中)随后将玻片置于70%的乙醇固定2min，空气干燥；加入浓度为10ng/mL的混合探针，探针以10%福尔马林杂交缓冲液稀释(20mmol/LTris-HCI，0.9mol/LNaCl，0.1%SDS，pH7.2)，于50℃下杂交30min～1h；置玻片于洗涤缓冲液中(20mmol/LTris-HCI，180mmol/LNaCl，pH7.2)于50℃下洗涤10min，蒸馏水洗涤后空气干燥；滴上1滴荧光媒介油，荧光显微镜下观察。

1.3 数据分析

对每条探针而言，敏感性即杂交法检出的靶细菌的阳性数占样本中靶细菌数的百分比，特异性即杂交法检出的靶细菌的阴性数占样本中非靶细菌数的百分比，以传统检测方法的结果为金标准。

2 结果

2.1 杂交条件的优化

1)血培养标本溶菌酶37℃处理15min，其他标本溶菌酶37℃处理30min。2)血培养标本50℃下杂交30min，其他标本50℃下杂交1h即可见到较强的荧光信号。

2.2 探针的特异性评价

在本研究中，使用了粪肠球菌3株，屎肠球菌1株，其他肠球菌7株，葡萄球菌属2株，链球菌属3株，微球菌1株。对探针的特异性进行测试表明，ENF191探针和ENU140探针分别只与粪肠球菌和屎肠球菌发生特异性结合，与属内其他肠球菌及形态相似的革兰染色球菌均无交叉反应。

2.3 杂交法与培养法结果比较

在163例肠球菌阳性标本中，传统法检测出粪肠球菌145株，屎肠球菌12株，其他肠球菌6株；杂交法中ENF191探针检测出粪肠球菌145株，ENU140探针屎肠球菌12株，其他6株肠球菌2条探针均未能检出，结果见表2。

表1 探针序列

表2 杂交法检测163例肠球菌临床标本结果评价

3 讨论

粪肠球菌和屎肠球菌是肠球菌中最常见的2种菌，可引起伤口、尿道感染及心内膜炎。在微生物实验室，快速、特异、准确地检测、鉴定病原菌，可有效地指导临床使用抗生素[3-4]。通常以自动化仪器或商品化试剂盒鉴定肠球菌，但有时结果并不可靠。如屎肠球菌可误鉴定为耐久肠球菌或海氏肠球菌。

16S rRNA基因序列分析最大的优势是检测速度快，常规的细菌培养方法无法与其相比。目前常将16S rRNA基因序列分析与形态学方法相结合，对细菌进行系统分类，用于临床常规的检测、鉴定[5]。

通过标准菌株对2条探针进行测试，显示出了很好的特异性，对163例肠球菌阳性标本进行2种方法比较，也证实了2条探针的高度特异性和敏感性，这与探针的设计和杂交条件的选择有关。实验中发现，10%福尔马林可保持杂交的严谨性。血培养与其他标本相比，预杂交和杂交时间均短，可能与血培养物为快速生长的细菌、细胞壁的通透性好有关。

在送检前使用过抗生素的标本中，可出现革兰染色阳性。但培养阴性的情况，杂交法不受此因素影响。在各类临床标本中，阳性血培养标本可直接鉴定，脓液、伤口分泌物也无需培养直接鉴定，尿液标本先离心后也可直接鉴定，但脑脊液、胸腹水等含菌量少的标本，受荧光原位杂交(fluorescence in situ hy-bridization, FISH)检测限103CFU/mL的影响[3]，需经培养后才可运用杂交法鉴定。

[1]李金钟.肠球菌分类与鉴定新进展[J].临床检验杂志,2006,24(3):228-230.

[2]王斌,朱旭慧,张蓓等.654株肠球菌的耐药性分析[J].国际检验医杂志,2006,27(3):285-286.

[3]王沛，Welling GW,Meesen N,等.荧光原位杂交法快速鉴定金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌[J].中华检验医学杂志,2004,21(2):434-436.

[4]Wellinghausen N,Bartel M,Essig A,et al.Rapid identification of clinically relevant enterococcus species by floresence in situ by-bridization[J].J Clin Microbiol,2007,45(10):3424-3426.

[5]李霞,高谦.16SrRNA基因序列分析在临床微生物中的应用[J].微生物与感染,2006,1(3):184-186.