高选择性铁离子荧光探针的合成及性质研究

黎俊波，李楠楠，余响林，王 俊，曾 艳

(武汉工程大学绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430074)

0 引 言

金属离子荧光探针因其在环境及生物化学领域的广泛应用而受到关注[1].铁离子是生命体必须的离子之一，很多细胞水平的生物及化学过程需要铁离子的参与[2-3]，因此，铁离子荧光探针的研究对于环境及生命科学都具有重大的意义;同时，铁离子是顺磁性的金属离子容易淬灭荧光，当前报道的很多铁离子探针都是基于荧光淬灭机理[4-5]，在实际应用中更希望探针分子与铁离子络合后能导致荧光增强而不是淬灭.近几年报道的荧光增强的铁离子探针还比较少[6-7]，设计合成新型的荧光增强的铁离子探针成为研究热点.

近年来，基于罗丹明染料的荧光探针因其可见光波长激发及原料易得而引起了科学界的关注；同时，罗丹明衍生物染料存在螺环与开环之间的平衡，当罗丹明染料处在螺环形式时没有荧光，而其开环状态却有强的荧光，利用金属离子调节这两种状态的平衡进而应用于其检测成为研究的热点[8-10].本研究中，笔者合成了一种新的罗丹明衍生物2，6-二罗丹明B酰肼西夫碱(2)，该化合物以罗丹明B为原料经两步反应得到.在乙腈溶液中，当用520 nm的光激发探针分子时，无荧光产生，而向其中加入Fe3+离子后，溶液变为粉红色，且在588 nm处有强的荧光，而其它金属离子加入后无强的荧光，该探针能高选择性的检测三价铁离子.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

核磁共振仪(德国Bruker公司，400 MHz)；Biflex III质谱仪(德国Bruker公司)；紫外光谱仪(日本岛津公司，1601型)；荧光光谱仪(日本日立公司，F-4500).

化学试剂均为分析纯国产试剂(除乙腈为色谱纯外)，溶剂均经常规纯化处理过程处理.金属离子Ni2+、Fe3+、Ag+、Pb2+、Ca2+、Cd2+溶液均用其水合硝酸盐配制而成，Cu2+、Zn2+、Mn2+溶液均用其水合高氯酸盐配制而成.

1.2 合成与表征

罗丹明酰肼(1)参照文献方法合成[10]，产率77%.

制备罗丹明衍生物(2)：取1.5 g罗丹明酰肼、0.44 g间苯二甲醛置于100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL绝对无水甲醇溶解，回流反应24 h，冷却至室温，过滤，用适量甲醇洗涤所得固体，真空干燥，甲醇重结晶得纯产物1.12 g，产率58%.1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ∶1.14 (t, J=6.92 Hz, 24H), 3.31 (q, J=6.92 Hz, 16H), 6.20 (d, J=8.56 Hz, 4H), 6.44-6.51 (m, 8H), 7.09 (d, J=8.56 Hz, 2H), 7.15-7.20 (m, 1H), 7.45-7.48 (m, 5H), 7.60 (d, J=6.88 Hz, 2H), 7.97 (d, J=6.88 Hz, 2H), 8.35 (s, 2H).13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ∶12.6, 44.2, 65.7, 98.0, 105.6, 107.9, 123.3, 123.6, 127.5, 128.0, 128.1, 128.4, 133.3, 135.3, 146.0, 148.9, 152.2, 152.8, 165.1. MALDI-TOF: calcd:1011.3, found:1011.6.

图1 罗丹明衍生物2的合成路线图

1.3 测量方法

准确移取3 mL浓度为5×10-6mol/L2的标准液于荧光池中，测定其紫外-可见吸收光谱及荧光光谱.再加入相应体积的10-2mol/L各种金属离子的溶液，摇匀，静置2 min，测定其荧光光谱.

荧光光谱测试过程参数：激发波长为520 nm， 狭缝宽度为5.0 nm/5.0 nm.

2 结果与讨论

2.1 光谱性质研究

如图2为罗丹明衍生物2(3 mL,5×10-6mol/L)及加入Fe3+(15 μL, 5×10-5mol/L)后的紫外-可见光吸收(图2A)及荧光光谱图(图2B)，由图可知，在乙腈溶液中化合物2是无色的，当向其中加入Fe3+.后，溶液马上变为粉红色，紫外-可见光谱对应于560 nm处产生强的吸收峰.当用520 nm光激发化合物2的乙腈溶液时，无荧光产生，而当向其中加入Fe3+后，其产生强的荧光，且最大发射峰值位于588 nm处.由光谱的变化情况可知，当向化合物2中加入Fe3+后，罗丹明螺环被打开，体系成开环状态，溶液颜色及荧光都从无到有，模拟了一个离子控制溶液颜色及荧光的“关-开”过程.

图2 化合物2及2+ Fe3+的紫外-可见吸收光谱(A)及荧光光谱(B)

2.2 选择性研究

测试了在罗丹明衍生物2的乙腈溶液(5×10-6mol/L)中加入各种过渡金属离子后的荧光光谱(激发波长为520 nm)，如图3所示，未加金属离子前，2的乙腈溶液无荧光，而在2中加入铁离子后，2的荧光显著增强(715倍)且红移至588 nm.Zn2+(99倍)和Pb2+(50倍)也导致荧光增强，但是他们的增强仅为铁离子的1/7和1/14，其它过渡金属离子增强都在5倍以下.因此，罗丹明衍生物2是一个高选择性的铁离子荧光探针.

图3 化合物2(5×10-6 mol/L)的乙腈溶液中加入的各种金属离子(5×10-5 mol/L)后溶液的荧光光谱

其它过渡金属离子对化合物2检测Fe3+的干扰情况进行了研究.在2的乙腈中加入其它过渡金属离子，再向其中加入Fe3+后其荧光增强效应(FEF为加入Fe3+后和加入Fe3+前荧光强度比值)变化如图4所示，加入Ag+、Cd2+、Hg2+、Zn2+后其荧光的增强效应稍有增加，这可能是上述离子的加入导致罗丹明衍生物的平衡进一步向开环移动.而加入Co2+、Cu2+、 Mn2+、Ni2+、Pb2+后荧光增强倍数减少，特别是Co2+和Cu2+，原因可能为这两种金属是顺磁性的金属，都具有较强的荧光淬灭能力，对罗丹明衍生物2的荧光有一定的淬灭作用.总而言之，其它过渡金属离子对铁离子检测的干扰很小.

图4 向化合物2中加入各种过渡金属离子后，再向其中加入Fe3+后的荧光增强效应

2.3 络合比例与络合常数测定

利用Job’s Plot方法配制了一系列化合物2与铁离子总浓度为1×10-5mol/L，浓度比分别为0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1和10∶0的溶液，分别测定其紫外-可见吸收光谱，在最大吸收波长561 nm处取值.如图5所示,当染料分子与铁离子浓度比为1∶2时吸光度达到最大值，表明Fe3+与染料的结合比为2∶1.

图5 在化合物2与铁离子总浓度为10-5 mol/L的CH3CN中，随铁离子比例的变化溶液在561 nm处吸收值的变化图

注：[2] + [Fe3+] =10-5mol/L.

在化合物2中逐步滴加Fe3+的荧光变化曲线如图6所示，随着铁离子的加入，染料在588 nm处的发射光不断增强，依据荧光滴定曲线数值，可以利用非线性拟合方法得到其络合常数，拟合公式如下[11]:

图6 滴加Fe3+至化合物2中时荧光光谱变化图

图7 Benesi-Hildebrand线性分析曲线

2.4 络合机理探讨

在化合物2与Fe3+的乙腈溶液中，加入EDTA(2×10-4mol/L)，溶液在588 nm处的荧光消失，罗丹明衍生物2又回到了关环状态.原因为EDTA具有强的过渡金属离子配位能力，其与铁离子的络合常数远大于罗丹明衍生物2与Fe3+，Fe3+进而与EDTA络合，罗丹明又回到了关环状态，荧光消失，罗丹明衍生物2的开环-闭环是一个可逆的过程.笔者推测染料化合物2与Fe3+的可能的络合方式如图8所示，罗丹明环上的羰基及西夫碱中的氮原子与Fe3+进行配位，而铁为六配位金属离子，另外四个配位点可能是与溶剂乙腈分子配位，形成1∶2的络合物.罗丹明染料位点与Fe3+络合后，螺环碳打开，形成了氧杂蒽环结构，这个共轭大键的形成使得其紫外-可见吸收及荧光大幅增强.

图8 铁离子与化合物2结合机理示意图

3 结 语

设计合成了一种新型的罗丹明衍生物2，结果表明，在乙腈溶液中化合物2为一个高选择性的Fe3+荧光探针；测试了向2的乙腈溶液中加入各种金属离子后的荧光变化情况，结果表明，加入铁离子后，化合物2在588 nm处的荧光相对值增加了715倍，其它过渡金属离子除Zn2+(99倍)和Pb2+(50倍)导致一定的荧光增强外都无荧光增强.后续工作重点为继续修饰其它特殊的官能团以增加化合物2类衍生物的水溶性，为其在环境检测及生物应用中打下基础.

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