丹参脂溶性成分提取方法研究

2010-05-26杨千才柳仁民

中成药 2010年4期

杨千才，柳仁民

（聊城大学化学化工学院，山东聊城 252059）

丹参为唇形科植物丹参Salviae miltiorrhizaeBge.的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效［1］，是治疗心脑血管疾病的传统中药材。现代研究发现丹参的化学成分主要分为脂溶性成分及水溶性成分两大类，脂溶性成分主要为二萜类化合物，如隐丹参酮、丹参酮 IIA、丹参酮 I等［2，3］;水溶性成分主要为酚酸性化合物，如丹参素、原儿茶酸、丹酚酸B等［4，5］。丹参酮类化合物是丹参的脂溶性主要成分，在生物体内的代谢产物由于参与机体的多种生物化学反应而表现出多种药理作用，对心脑血管疾病、肝炎、白血病等具有潜在的治疗作用［6，7］。

有关丹参酮的提取工艺文献报道很多［8-10］，然而大都是以极性较大的乙醇作为提取溶剂，结果导致提取物中水溶性成分含量高，而丹参酮的相对含量较低，不利于后续对丹参酮的分离纯化。本试验考虑使用极性较小的提取溶剂，不但对于丹参酮类脂溶性成分会有较好的提取效果，而且会大大降低提取物中水溶性成分的含量，这样水溶性成分更多的留在了药渣内，也更有利于进一步对药渣中水溶性成分的提取，达到综合提取丹参有效成分的目的。

1 仪器、试剂与药材

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），包括G1311A四元泵，G1315B阵列二极管检测器，Rheodyne7225i定量进样阀，G1322A在线真空脱气机，Agilent HPLC化学工作站。

UV-2100紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司），FZ102微型植物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），AR-1104D电子天平（奥克斯国际贸易上海有限公司），SK3300LH超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），RE-52旋转蒸发器（上海青浦沪西仪器厂），HH-6数显恒温水浴器（常州国华电器有限公司）。

1.2 试剂与药材乙酸乙酯、二氯甲烷为分析纯（天津市化学试剂三厂），95%乙醇（山东广源医药酒精有限公司），HPLC所用甲醇为色谱纯（Tedia Company，USA），水为过滤的蒸馏水。

隐丹参酮与丹参酮IIA对照品为本实验室从丹参根中分离纯化制得，经HPLC测定纯度均大于99%，结构经1HNMR与13CNMR得以鉴定。

丹参药材购于聊城市中医医院，经山东中医药大学张永清教授鉴定为正品药材。

2 实验方法

2.1 色谱条件色谱柱:Spherigel C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，大连江申分离科学技术公司）;流动相:甲醇-水（75∶25，v/v）等度洗脱;流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;温度:室温;进样量:20 μL。在此色谱条件下，丹参酮类成分可以获得较好的分离，隐丹参酮、丹参酮IIA对照品溶液及丹参粗提物的色谱图如图1所示。

2.2 标准曲线的制备

2.2.1 供HPLC测定用标准曲线的制备分别准确称取隐丹参酮对照品4.0 mg，丹参酮IIA对照品5.6 mg，置50 mL量瓶中，加适量甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度分别为隐丹参酮80 μg/mL，丹参酮IIA112 μg/mL的对照品溶液。精密吸取对照品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、7.0 mL，分别置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀;分别精密吸取20 μL，依次进样，记录色谱峰面积。以色谱峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，得回归方程:隐丹参酮:Y=40.933X+48.154，r=0.999 7;丹参酮 IIA:Y=24.533X+80.923，r=0.999 9。结果表明，隐丹参酮、丹参酮 IIA分别在 8～56 μg/mL、11.2～78.4 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

图1 隐丹参酮（A）、丹参酮IIA（B）及丹参粗提物（C）的色谱图

2.2.2 供总丹参酮测定用标准曲线的制备精密称取60℃减压干燥至恒重的丹参酮IIA对照品1.2 mg，置10 mL量瓶中，用氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.112 mg/mL的丹参酮IIA对照品溶液。精密吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.7 mL，置于 10 mL量瓶中，用氯仿稀释至刻度，使浓度分别为1.12、2.24、4.48、6.72、7.84 μg/mL，以氯仿为空白，于波长271 nm处测定吸光度。以吸光度（A）对浓度（C）进行一元线性回归，得回归方程为:A=0.086C+0.003，r=0.999 7，结果表明丹参酮IIA对照品在1.12～7.84 μg/mL的浓度范围内呈线性关系。

2.3 样品溶液的制备

2.3.1 供HPLC测定用样品溶液的制备丹参药材粉碎过30目筛，混合均匀。准确称取丹参粉末适量，加入一定量的溶剂，用不同的方法提取，提取液过滤，减压浓缩至干，得到丹参酮粗提物。称取适量粗提物，用甲醇溶解并定容至一定体积，经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.3.2 供总丹参酮测定用样品溶液的制备准确称取2.3.1项下方法制备的丹参酮粗提物适量，用氯仿溶解并定容至一定体积，得供试品溶液。

2.4 样品含量测定

2.4.1 HPLC法测定样品中丹参酮IIA和隐丹参酮的含量精密量取2.3.1项下方法制备的样品溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，代入标准曲线计算含量。

2.4.2 紫外分光光度法测定样品中总丹参酮含量取2.3.2项下方法制备的样品溶液于271 nm处测定溶液的吸光度，代入标准曲线计算总丹参酮的含量。

3 结果与讨论

3.1 提取溶剂与提取方法的选择使用超声和回流两种提取方法，以总丹参酮、隐丹参酮和丹参酮IIA为评价指标，用分光光度计和HPLC进行分析测定，在提取时间、液固比相同的条件下比较了95%乙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷三种极性各不相同的溶剂对丹参酮类成分的提取效果，结果列于表1中。

从表1可见提取溶剂对丹参酮的提取效果有很大的影响。当使用极性较大的乙醇作为提取溶剂时，由于选择性不高，尽管丹参酮的绝对量较高，但是由于极性大的丹酚酸类成分的溶出量也最高，因此导致提取液中丹参酮的相对含量降低。当采用极性较小的乙酸乙酯或二氯甲烷作为提取溶剂时，由于此时水溶性成分溶出量降低，因此丹参酮的相对含量明显提高。鉴于二氯甲烷的毒性较强，乙酸乙酯为最佳提取溶剂。另外提取方法对丹参酮的提取效果也有较大的影响，使用乙酸乙酯回流提取所得丹参酮的量多于超声提取，这是由于丹参酮的溶解度随温度升高而增大。故而最终确定乙酸乙酯热回流为丹参脂溶性成分的最优提取方法。

表1 不同的提取溶剂和方法对丹参酮类成分的提取效果（n=3）

3.2 单因素试验及结果

3.2.1 液固比的选择乙酸乙酯为提取溶剂，回流提取时间为0.5 h，液固比（mL/g）分别为3∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10 ∶1、20 ∶1，室温条件下考察液固比对丹参药材中丹参酮提取率（mg/g）的影响，结果（n=3）见图2。

图2 液固比对提取率影响

由图2可知，随液固比的增加，丹参药材得到完全浸润，使得有效成分很好地溶出，当液固比为8:1时，隐丹参酮和丹参酮IIA的提取率达最大值;此后，随液固比的增加，提取率略有下降。考虑到溶剂利用的经济效益，在合适的范围内选择较小的液固比较合适。

3.2.2 提取时间的选择乙酸乙酯为提取溶剂，液固比为8 ∶1，回流提取时间分别为 0.5、1 h、1.5、2 h，室温条件下考察提取时间对丹参药材中丹参酮提取率（mg/g）的影响，结果（n=3）见图3。

图3 提取时间对提取率影响

由图3可知，随着提取时间的增加，隐丹参酮收率变化不大，而丹参酮IIA在1.5 h之后收率有明显下降的趋势。这是因为丹参酮IIA不稳定，在长时间的提取过程中会转化分解［11］，故选择较短的回流时间更为合适。

3.2.3 提取温度的选择乙酸乙酯为提取溶剂，液固比为8∶1，回流提取时间为0.5 h，提取温度分别为50、60、70、80、90 ℃，室温条件下考察温度对丹参药材中丹参酮提取率（mg/g）的影响，结果（n=3）见图4。

图4 温度对提取率影响

由图4可知，从60℃到70℃，随温度升高，丹参酮的提取率缓慢上升，70℃时达极大值，而超过70℃，却有较明显的下降，这是由于丹参酮类成分的稳定性受湿热影响很大，温度过高，丹参酮发生分解所致［12，13］，所以加热温度控制在70℃比较合适。3.2.4 提取次数的选择乙酸乙酯为提取溶剂，液固比为8∶1，回流提取时间为0.5 h，提取温度为70℃，分别提取1、2、3和4次，室温条件下考察提取次数对丹参药材中丹参酮提取率（mg/g）的影响，结果（n=3）见图5。