玉郎伞多糖对慢性应激小鼠不同脑区腺苷酸环化酶的影响

梁 霜， 王乃平， 付书婕， 黄仁彬*

（1.广西医科大学药理学教研室，广西南宁 530021;2.南宁市第二人民医院，广西南宁 530013）

Wei的块根中提取的有效成分，本课题组前期研究表明，YLSPS可显著缩短行为绝望动物模型的累计不动时间，提高脑内单胺类神经递质浓度，并与α2－肾上腺素受体有关。现有理论认为，抑郁症的发生不仅与脑内神经递质及其受体有关，还涉及受体后信号传导系统。单胺受体后腺苷酸环代酶（adenylate cyclase，AC）活性对神经元保护和神经元再生有着重要的影响。经典的抗抑郁药对脑内AC有调节作用，并且激活脑内 cAMP－CREB（cAMP responseelement－binding protein，cAMP反应元件结合蛋白）通路，这也被认为是抗抑郁药作用的重要机制［1，2］。因此，为更深入探讨YLSPS抗抑郁作用机制，本研究采用放射免疫法测定YLSPS对慢性应激小鼠不同脑区AC活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种小鼠，SPF级，♂性，体重（18±22）g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK（桂）2003－0003。

1.2 实验药物 YLSPS，由本室自行提取（玉郎伞经醇提后的药渣用热水提取，乙醇沉淀，Sevag试剂脱蛋白，采用DEAE纤维素（DEAE－52）柱层析分离纯化，分离得到的YLSPS经Sephadex－75凝胶柱层析，硫酸－苯酚法以及高效凝胶渗透色谱法证实为高纯度多糖，纯度95%，紫外扫描显示无核酸和蛋白特征吸收峰，薄层色谱和气相色谱表明由葡萄糖和阿拉伯糖组成，红外光谱显示有典型的多糖吸收峰）。实验前将各试药用蒸馏水配成所需浓度，4℃冷藏备用。

1.3 仪器与试剂 GC－1200γ放射免疫计数器（中国科学技术大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司）;TGL－16G－A低温离心机;FJ－200高速均质分散机（上海标本模型厂）。环磷酸腺苷放射免疫分析试剂盒（北京普尔伟业生物科技有限公司，批号:20081024）。

1.4 方法

1.4.1 慢性应激抑郁模型的制备、动物分组和给药 参照大鼠不可预知的慢性应激模型、大鼠慢性不可预知的温和性应激模型［3］和小鼠慢性应激模型［4］建立。将小鼠随机分成6组:空白组、模型组、氟西汀组（FLU组）、YLSPS低剂量组（YLSPSL组）、YLSPS中剂量组（YLSPSM）、YLSPS高剂量组（YLSPSH），每组10只。空白组正常饮食水，不给予任何刺激。其余各组均接受21 d的不可预知慢性刺激。刺激包括:冷水游泳（10 ℃，5 min）、夹尾（1 min）、悬吊30 min、禁水（24 h）、禁食（24 h）、潮湿饲养（将200 mL水加入有锯末的笼底，24 h）和昼夜翻转。刺激方式以每日1次随机交替。

1.4.2 取材和样品处理 将小鼠断头，在冰台上迅速分离前额皮层、下丘脑、海马，称重。取组织50 mg，加入2 mL冷的50 mM pH4.75醋酸缓冲液（27.22 g NaAc·3H2O溶于1 000 mL蒸馏水，即为 0.2 mol/L NaAc。用冰醋酸配制0.2 mol/L醋酸，然后取410 mL 0.2 mol/L HAc和590 mL 0.2 mol/L NaAc混匀，测pH值调到pH4.75，然后每1 000 mL溶液加入5.95 g EDTA二钠盐溶解即得200 mM pH 4.75醋酸缓冲液，用时1∶4稀释）的试管内（冰浴），匀浆，加入2 mL无水乙醇，混匀，静止5 min，3 500 r/min冷冻高速离心15 min，将上清液收集在青霉素小瓶内，再用75%乙醇2 mL洗沉淀，匀浆分散，混匀，3 500 r/min冷冻高速离心15 min，合并上清液，60℃烤箱中吹干，残渣放于4℃保存。测时用1 mL醋酸缓冲液溶解，取0.1 mL测量。

1.4.3 环磷酸腺苷（cAMP）的测定 严格按照环磷酸腺苷放射免疫分析试剂盒要求测定各反应管中cAMP产生量。反应结束后，3 000 r/min离心15 min，小心吸去上清液。在γ放射免疫计数器上测定沉淀CPM数。根据标准曲线计算cAMP的产生量。

2 结果

经慢性应激后，模型组小鼠前额皮层、下丘脑、海马cAMP产生的量明显降低，与空白组相比具显著性差异（P＜0.01）。与模型组组相比，FLU（20 mg/kg）和YLSPA各剂量组（150、300、600 mg/kg）均可增加慢性应激小鼠前额皮层、下丘脑、海马cAMP产生的量（P＜0.01）。结果提示FLU在20 mg/kg、YLSPS在150～600 mg/kg的条件下可激活慢性应激小鼠前额皮层、下丘脑、海马AC活性。结果见表1。

表1 YLSPS对慢性应激小鼠各脑区AC活性的影响（±s，n=10）

表1 YLSPS对慢性应激小鼠各脑区AC活性的影响（±s，n=10）

注:与空白组比较，*P＜0.05，**P ＜0.01;与模型组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

cAMP/（ng/mL）前额皮层 下丘脑 海马空白组 － 128.10±9.53▲▲ 84.90±10.10▲▲ 93.10±2.42组别 剂量/（mg/kg）▲▲模型组 － 88.70±4.57** 62.30±3.23** 65.60±8.25**FLU组 20 124.75±4.02▲▲ 83.80±1.99▲▲ 88.00±3.23▲▲YLSPSL 150 101.40±9.24**▲▲ 74.40±4.20**▲▲ 75.90±4.58**▲▲YLSPSM 300 121.00±4.47*▲▲ 79.10±2.16*▲▲ 84.80±1.87**▲▲YLSPSH 600 124.10±5.09▲▲ 84.10±1.91▲▲ 88.40±9.42▲▲

3 讨论

抗抑郁药的作用机制目前尚不明确，传统单胺递质理论和受体理论无法充分解释抗抑郁药的临床效应滞后现象。目前普遍认为抑郁症发病不仅限于神经递质和受体的改变，还会累及受体后的信号通路。近年来的研究证实，抑郁患者大脑皮层腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）活性降低，大脑神经细胞内cAMP信号通路（cAMP signal pathway）功能紊乱［5］。抑郁症与cAMP信号通路的功能异常密切相关，经抗抑郁剂处理后能逆转 AC活性水平低下的状态［6］，诱导cAMP 通路代偿性增强［7］。

cAMP信号通路又称PKA（protein kinase A，蛋白激酶A）系统，是环核苷酸系统的一种。在这个系统中，细胞外信号与相应受体结合，通过调节细胞内第二信使cAMP的水平而引起反应的信号通路。信号分子通常是激素，对cAMP水平的调节，是靠AC进行的。cAMP通路的激活可能是抗抑郁剂产生治疗效果的途径之一。很多抗抑郁药物都增加了突触NE和/或5－HT的浓度，这些神经递质与细胞膜上相应的受体结合（如G蛋白），G蛋白可调节AC的活性，AC可大量催化ATP转变成cAMP，使神经细胞内的cAMP浓度增高，cAMP作为第二信使进一步激活PKA，活化的PKA转运至细胞核，使转录因子cAMP反应元件结合蛋白（cAMP－responsive element binding protein，CREB）的Ser133位丝氨酸磷酸化，CREB的磷酸化可以实现对相关基因的诱导和调控。研究表明，AC是G蛋白偶联信号转导途径中一个重要的酶，AC可能是新型组织及细胞特异性药物的作用靶点，抗抑郁剂对cAMP通路的激活具有特异性，因此AC也就成为药物筛选的相对特异的指标之一。

前期研究发现，YLSPS对行为绝望动物模型和慢性应激小鼠模型具有显著的抗抑郁作用，能直接或间接提高慢性应激小鼠脑中NE、5－HT、DA含量。为深入探讨YLSPS抗抑郁作用的机制，本研究采用放射免疫方法考察YLSPS对慢性应激小鼠不同脑区AC活性的影响。结果表明，YLSPS各剂量组能显著提高慢性应激小鼠前额皮层、下丘脑和海马AC活性。因此，YLSPS影响小鼠前额皮层、下丘脑和海马AC活性可能是其抗抑郁活性的重要机制之一。YLSPS在抗抑郁作用中是如何影响不同脑区AC活性尚需进一步研究。

［1］Li Y F，Gong Z H，Cao J B，et al.Antidepressant－like effect of agmatine and its possiblemechanism［J］.Eur J Pharmacol，2003，469:81－88.

［2］Li Y F，Luo Z P.Depression:neuron lesion and neurogenesis down－regulation［J］.Acta Pharm Sin，2004，39:949－953.

［3］Harkin A，Houlihan D D，Kelly J P.Reduction in preference for saccharin by repeated unpredictable stress in mice and its prevention by imipramine［J］.J Psychopharmacol，2002，16（2）:115－123.

［4］Li Y F，Yuan L，Xu Y K，et al.Antistress effect of oligosaccharides extracted from Morinda officinalis in mice and rats［J］.Acta pharmacol Sin，2001，22（12）:1084－1088.

［5］Eric J N，Michel B，Ralph J D，et al.Neurobiology of depression［J］.Neuron，2002，34（1）:13－25.

［6］Hines L M，Tabakoff B.Platelet adenylyl cyclase activity:a biological marker for major depression and recent drug use［J］.Biol Psychiatry，2005，15;58（12）:995－962.

［7］D＇Sa C，Eisch A J，Bolger G B，et al.Differential expression and regulation of the cAMP－selective phosphodiesterase type 4A splice variants in rat brain by chronic antidepressant administration［J］.Eur J Neurosci，2005，22（6）:1463－1475.