番石榴叶颗粒HPLC指纹图谱研究

何宇新， 吴晶晶， 李 玲， 陈慧娟

（1.西华大学生物工程学院，四川成都 610039;2.四川省中医药研究院中医研究所，四川成都 610031）

番石榴叶颗粒是由番石榴叶一味中药组成的颗粒剂，主要用于糖尿病的治疗。番石榴叶属于桃金娘科番石榴属的常绿灌木番石榴（Psidium guajavaLinn.）的叶子，用于治疗急、慢性肠炎，痢疾，小儿消化不良，糖尿病等症。现代研究表明番石榴叶的主要功效成分为芳香类二级代谢产物多酚类物质，现已发现含有槲皮素（quercetin）、萹蓄苷（avicularin）、番石榴苷（guaijacerin，C20H18O11）即槲皮素－3－α－L－吡喃阿拉伯糖苷等。试验表明，正是这些酚类化合物赋予番石榴叶多种功效［1－3］。本文对番石榴叶颗粒进行指纹图谱研究，为有效控制番石榴叶颗粒的质量提供技术支持。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 日本岛津高效液相色谱仪（LC－20高效液相色谱仪）;Milli－Q Academic超纯水仪（密理博中国有限公司）;JJ1004小型超声波清洗机（东莞市嘉劲机械有限公司）;中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版（国家药典委员会）。

1.2 试剂 甲醇为色谱纯（美国迪马DIKMA试剂公司）;槲皮素对照品购于中国药品生物制品检定所;番石榴叶颗粒颗粒（自制）。

2 方法与结果

2.1 番石榴叶颗粒指纹图谱方法学研究

2.1.1 色谱条件 色谱柱:C18（Scienhome 250 mm×4.6 mm），Agilent数据处理软件。由预试验结果得出，流动相:A:甲醇，B:0.4%磷酸水溶液，按表1进行梯度洗脱。流速:1.00 mL/min;柱温:40℃;检测波长:360 nm;记录时间70 min;进样量 10 μL。

表1 梯度洗脱表

2.1.2 参照物的选择 番石榴叶颗粒中黄酮类成分的指标成分主要为槲皮素，经检测在本色谱条件，槲皮素峰面积较大，分离度较高，其相对保留时间及峰面积较稳定，故选择槲皮素为参照物。

2.1.3 供试品溶液的制备 取自制的番石榴叶颗粒2 g，加甲醇20 mL超声40 min，过滤，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得。

2.1.4 精密度试验 取同一份供试品溶液，连续进样5次，对各共有峰的保留时间及峰面积进行考察，结果表明相对保留时间RSD＜1%、相对峰面积的RSD＜3%，说明精密度良好。

2.1.5 重复性试验 取同一份样品5份，按上述供试品溶液制备方法制得，每份进样1次，对各共有峰相对保留时间及相对峰面积进行考察，结果表明，相对保留时间RSD＜1%、相对峰面积RSD＜3%，说明重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h进样分析，对各共有峰相对相对保留时间及相对峰面积进行考察，结果表明，相对保留时间RSD＜1%、相对峰面积RSD＜3%;说明在8 h内，样品溶液稳定。

2.2 番石榴叶颗粒指纹色谱的建立

2.2.1 原药材指纹图谱的测定 精密称取粉碎过100目筛的番石榴叶粉末0.1g，加20mL甲醇，称定重量后超声30 min，补足失重，过滤即得。其色谱图见图1所示。

图1 番石榴叶原药材指纹图谱

2.2.2 样品的测定及共有峰的指定 取10批自制的番石榴叶颗粒，分别按供试品溶液的制备方法制备，再按表1所示方法进行HPLC指纹图谱测定。通过比较10批供试品溶液的指纹图谱，其中有10个峰为各样品所共有，6号峰不是绝对意义上的一个峰，它是由两个分离不完全的峰组成，这2个峰在每批色谱图上都出现，但分离欠佳，按《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》［4］将其整体看做一个峰;10号峰为一强峰，经与槲皮素对照品进行比较，确定此峰为槲皮素的特征峰。最后确定10个峰为共有峰（见图2），样品的总出峰数为39个峰，共有峰面积占总峰面积的92.2%，且其中超过总峰面积5%的色谱峰有6个，分别为5号、6号、7号、8号、9号、10号。

图2 番石榴叶颗粒指纹图谱共有峰的标定

2.2.3 样品共有峰相对保留时间、相对峰面积 以10号峰为参照峰，其α值为1，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，6号峰以两峰的平均保留时间、平均峰面积同参照峰比较。结果如表2、3所示，各峰的相对保留时间和相对峰面积均小于2%。符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》中的有关规定。

表2 指纹图谱共有峰相对保留时间

2.2.4 相似度计算 利用国家药典委员会的“中药色谱指纹图谱相似性评价系统”对所选取的10个共有峰进行相似度计算。谱峰处理:自动谱峰匹配;时间窗宽度:0.2;相似度计算（全谱）见表4。以S5为参照图谱，其全谱相似度分别为 0.982、0.982、0.985、0.920、0.920、0.920、0.984、0.985、0.982、0.984;即10批样品的相似度均在0.9以上，符合质量要求。

表3指纹图谱共有峰相对峰面积

表4 10批样品HPLC指纹图谱相似度计算结果

3 讨论

3.1 番石榴叶颗粒是以单味药为原料，经过提取、浓缩、除杂、干燥、制粒等工艺制成颗粒状制剂。本文对番石榴叶颗粒的指纹图谱进行研究，为其质量评价提供依据。

3.2 流动相的选择 本试验比较了等度洗脱和梯度洗脱对指纹图谱的影响，结果发现，等度洗脱得到的峰分离效果不好，色谱峰也较少，故确定使用梯度洗脱使样品中不同极性组分均获得了合适的保留值;本试验考察了甲醇－水梯度洗脱，甲醇－0.4%磷酸水溶液梯度洗脱。比较色谱图，甲醇－0.4%磷酸水溶液系统出峰峰形较好，无拖尾现象，基线较平。故选择甲醇－0.4%磷酸水溶液系统梯度洗脱分离。

3.3 检测波长的确定 在选定的色谱条件下，结合DAD检测器得到的三维图谱，最终确定360 nm处，出峰较多，峰形较好，分离度较好，基线平稳。故选择360 nm为检测波长。

3.4 检测时间的测定 在选定的色谱条件下，进行一次2 h的检测，发现70 min后，没有新的峰出现，故确定检测时间为70 min。

［1］黄建林，张展霞.GC－MS分析番石榴叶乙醇提取物的化学成分［J］.中山大学学报（自然科学版），2004，43（6）:117－121.

［2］Harborne J B.Plant phenolics［M］.Academic press，New York:1989.

［3］Begum S，Hassan SI，Siddiqui BS，et al.Triterpenoids from the leaves of Psidium guajava［J］.Phytochemistry，2002，61（4）:399－403.

［4］国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）［J］.中成药，2000，22（10）:671－675.