塞来昔布对人胶质瘤U251细胞增殖及NF-κB蛋白表达的影响

熊一峰，梅金红，徐林林，王珊珊，涂 轶

(南昌大学第一附属医院，南昌330006)

胶质瘤是颅内最常见的肿瘤［1］，目前多采用手术为主、放化疗为辅的综合治疗，但疗效不理想。近年研究显示，非甾体类抗炎药与癌症危险性降低有关。2009年6月，我们观察了新型非甾体类抗炎药塞来昔布对人胶质瘤U251细胞增殖及NF-κB表达的影响，旨在进一步探讨其可能的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胶质瘤U251细胞(湘雅中心实验室);塞来昔布，以二甲基亚砜(DMSO)溶解，0.22 μm滤器滤过除菌，4℃保存，使用前用培养液配置;TNF-α;DMEM 培养基，噻唑蓝(MTT)，胰酶，FBS，NF-κB p65鼠抗人一抗，MaxVision检测试剂盒，DAB染液。

1.2 U251细胞培养及分组处理 将U251细胞置于含10%FBS，100 U/ml青霉素及100 U/ml链霉素的DMEM培养基中，37℃、5%CO2培养箱内培养，至细胞70%～80%融合时于0.25%胰蛋白酶消化、传代，至对数生长期后以1.0×104/ml接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μl，细胞贴壁后随机分为塞来昔布组、TNF-α组，每组设6个复孔。两组均分别加入 0、10、25、50、100 μmol/L 的塞来昔布，其中TNF-α组于1 h后每孔加50 ng/ml TNF-α。

1.3 U251细胞增殖水平及抑制率测定 采用甲基噻唑蓝(MTT)法。两组均于培养24 h后每孔加入DMSO溶液150 μl，轻轻震荡15 min，使结晶物充分溶解，以空白孔调零，以酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定各孔光密度值(OD值)，取平均值代表细胞增殖水平。以对照组细胞存活率计为100%，细胞抑制率:(1-实验组OD值 /对照组OD值)×100%。

1.4 NF-κB蛋白在U251细胞内分布及核内表达检测 ①细胞内分布:取上述对数生长期U251细胞以5.0×105/ml接种于6孔培养皿中，细胞贴壁后同1.2分组及处理，各组均于培养1.5 h后用预冷丙酮室温固定15 min，PBS漂洗3遍，加穿透剂0.3%TritonX-100作用 15 min，按 MaxVisionTM说明书行免疫组化染色，在显微镜下观察NF-κB蛋白在U251细胞内分布情况。②核内表达:采用Western blot法。取上述对数生长期U251细胞分为四组，A组不予特殊处理，B组予50 ng/ml TNF-α，C组予50 μmol/L塞来昔布 +50 ng/ml TNF-α，D组予 100 μmol/L塞来昔布+50 ng/ml TNF-α。各组均采用普利莱核蛋白提取试剂盒提取各组核蛋白，取20 μl蛋白样品，以10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转膜及封闭，将膜分别移入含NF-κB p65、增殖细胞核抗原(PCNA)的一抗反应液中(工作浓度为1∶500)4℃过夜;洗膜，浸入增强化学发光试剂1 min，X线片曝光。以NF-κB p65灰度值/PCNA代表其核内表达情况。

1.5 统计学方法 采用SPSS 14.0软件进行统计学处理。计量数据采用±s表示、行方差分析，组间比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 U251细胞增殖水平及抑制率 随塞来昔布浓度增加，两组增殖水平均降低、增殖抑制率均升高，组间比较无显著差异，见表1。

2.2 NF-κB蛋白在U251细胞内分布及表达 未行任何处理者p65蛋白在细胞核内外均有表达，且胞质内表达强于核内;仅经50 ng/ml TNF-α者，p65蛋白在细胞核内表达明显强于胞质内(靠近细胞核表达);而经塞来昔布预处理者p65蛋白主要表达在胞质内，核内表达甚少。NF-κB p65灰度值/PCNA:A、B、C、D 组分别为 1.444 5、3.174 3、0.860 9、0.443 9，两两比较P均＜0.05。

表1 二组U251细胞增殖水平及抑制率(±s)

表1 二组U251细胞增殖水平及抑制率(±s)

注:与上一浓度比较，*P＜0.05

组别 增殖水平(OD值) 增殖抑制率(%)塞来昔布组(μmol/L)0 0.929±0.061 0 10 0.774±0.041* 16.62*25 0.608±0.107* 34.51*50 0.416±0.082* 55.20*100 0.299±0.022* 69.86*TNF-α 组(μmol/L)0 1.078±0.125 -7.03 10 0.848±0.099 8.68*25 0.689±0.022* 31.07*50 0.431±0.017* 53.57*100 0.265±0.028* 71.00*

3 讨论

人胶质瘤U251细胞株和人体真实的肿瘤性状具有很强的相似性，是研究胶质瘤的常用细胞株。塞来昔布为选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂的代表药物，具有抗炎、镇痛及退热作用，特点为胃肠道毒副作用小及可长期耐受等，目前其抗肿瘤作用已引起广泛关注，有报道其可抑制多种肿瘤的生长［2，3］。NF-κB 是体内重要的核转录因子，与多种肿瘤的发生、发展和浸润转移有关，且在肿瘤细胞抵抗放化疗过程中发挥一定作用［4～6］。正常情况下，NF-κB由p50/p65组成二聚体，与抑制性κB蛋白结合成三聚体，以无活性方式存在于细胞质中;细胞受TNF-α、IL-1、致癌物等刺激时κB蛋白被降解，活化的p50/p65进入细胞核，与κB结合位点结合，启动转录。NF-κB异常活化导致细胞周期调节失控，表现为细胞无限增殖和自主分裂，肿瘤形成;另一方面，NF-κB可通过上调促细胞存活基因和抗凋亡基因表达保护细胞使其免于凋亡［7］。p50/p50同源二聚体中p50结构不含有反式激活域，具有识别并结合κB序列的能力，但缺乏靶基因转录表达的能力;而p50/p50可竞争性抑制p50/p65与κB序列的结合，对NF-κB调控起负反馈作用，故p65蛋白为代表NF-κB的最好蛋白亚基。本研究显示，塞来昔布浓度为10～100 μmol/L时两组细胞增殖抑制率均显著高于浓度为0者且呈浓度依赖性，增殖水平则相反，组间比较无显著差异。提示塞来昔布对U251细胞增殖有抑制作用，但与TNF-α无协同作用。本研究还显示，塞来昔布浓度为50、100 μmol/L时，NF-κB蛋白在细胞核内的表达减少，且呈浓度依赖性。提示塞来昔布可能参与了对NF-κB核转运相关蛋白如TNF-α的作用，并非真接抑制 NF-κB，此亦可能为其抑制U251细胞增殖的机制之一。

总之，塞来昔布可抑制人胶质瘤U251细胞增殖，可能机制为抑制NF-κB向核内移位。

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