三种实用而简单的急性酶分离动脉平滑肌细胞的方法＊

程俊 曾晓荣 李鹏云 李妙龄 刘智飞 裴杰 杨艳

(四川省泸州医学院心肌电生理学研究室,四川 泸州 646000)

单个细胞的获取已经广泛应用到科研工作的各个领域中,成为科研工作中不可或缺的对象,获取单个动脉平滑肌细胞常用的方法有贴块法和急性酶分离法。急性酶分离法由于酶的作用使细胞间失去连接,细胞内肌丝含量丰富,保持收缩型状态,适用于单细胞的研究,常应用到膜片钳技术、共聚焦显微技术、胞内物质的测定、流式细胞仪技术等研究领域。这些研究对单个细胞的要求都非常高,需要细胞获取率高、活性好、膜光滑、膜的折光性好。而影响急性酶分离法的关键因素在于控制酶的浓度、消化时间、消化温度等。那怎么样才能获取单个的高质量的动脉平滑肌细胞呢?现就笔者从事多年的动脉平滑肌细胞的研究工作的经验,以单个人体肠系膜动脉平滑肌细胞应用于膜片钳技术中为例,介绍几种实用的急性酶分离动脉平滑肌细胞的方法,以供大家参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 配置溶液

台式液(mmol◦ L-1)：NaC1127、KC15.9、MgC121.2、CaC122.4、Glucose 12、HEPES 10,pH 7.4(with NaOH)。无钙台式液除不含CaC12外,其余成分与台式液一致[1];单通道膜片钳电极内液(mmol◦ L-1)：KC1100、K-Asp 40、HEPES 10、EGTA 2,pH 7.2-7.4(with KOH);单通道膜片钳浴液(mmol◦ L-1)：KCl 40、K-Asp 100、HEPES 10、EGTA 2,pH 7.4(with KOH);穿孔膜片钳电极内液组成(mmol◦L-1)[4]：KCl 140,M gCl24.0,HEPES 10,EGTA 0.05,pH=7.2(with KOH),其中 Amphotericin-B 为200μ g◦ml-1[2];全细胞膜片钳浴液组成(mmol◦L-1)[5]：NaCl 137,KCl 5.9,MgCl21.2,CaCl21.8,HEPES 10,Glucose 14,pH=7.4(with NaOH)[3]。

1.1.2 标本来源

标本取自于泸州医学院附属医院腹部手术病人切除物中肠系膜动脉细小分支,取下肠系膜组织,立即放于台氏液中,用冰块保存迅速返回实验室,游离出小动脉,剔除表面的结缔组织和外膜,在体式显微镜下纵向剖开,剪成2-3 mm的小块备用。

1.1.3 酶液的组成

H型胶原酶法酶液组成(mg◦ml-1)：酶Ⅰ：Papain 1.25,DTT 2.0,Alb 2.0;酶 Ⅱ ：H 型Collagenase 1.25,Hyaluronidase 1.5,Alb 2.0[4]。

F型胶原酶法酶液的组成(mg◦ml-1)：酶Ⅰ：Papain 1,DTT 0.68,Alb 2.0;酶 Ⅱ ：F 型 Collagenase 1.615。

Ⅺ型胶原酶法酶液的组成(mg◦ml-1)：酶Ⅰ：P 1.3,DTT 0.15,Alb 1.7;酶Ⅱ：Ⅺ型Collagenase 1.3,Hyaluronidase 1.1,Alb 1.7。

1.2 方法

1.2.1 分离血管平滑肌细胞

1.2.1.1 H型胶原酶法

在20-25℃室温下,在37℃恒温水浴中,将组织块放入酶液Ⅰ中消化10-12min,用无钙台式液中止消化,迅速转入酶液Ⅱ中消化6-8min,用无钙台式液中止消化,再用尖端圆滑的玻璃吸管轻轻吹打,将细胞悬液连同组织滴于载玻片上,当在倒置显微镜下观察到组织上细胞之间连接较松散,且有多个单个膜光滑、折光性好的细胞时,即可中止所有的消化,将细胞悬液放于4℃冰箱中,静置10-30min,再次轻轻吹打组织,将细胞悬液铺于盖玻片上,放于4℃冰箱中备用[3-4]。

1.2.1.2 F型胶原酶法

酶液Ⅰ中消化9-12min,酶液Ⅱ中消化6-8min,其余步骤同H型胶原酶法。

1.2.1.3 Ⅺ型胶原酶法

酶液Ⅰ中消化8-10min,酶液Ⅱ中消化4-6min,其余步骤同H型胶原酶法[4]。

1.2.2 人体肠系膜动脉平滑肌细胞形态学观察

1.2.2.1 单通道膜片钳实验

玻璃微管电极用微管电极拉制器(日本PC-10,NARISHIGE)两步拉制,充灌电极液后电极尖端阻抗约10-15 MΩ。取酶分离后24 h内的人体肠系膜动脉平滑肌细胞,室温20-25℃,细胞内外为140 mM对称性高钾溶液下进行实验。将贴有细胞的盖玻片放入盛有1ml浴液的实验小槽中,在倒置相差显微镜下找到贴壁好、折光性好、膜光滑的细胞,用微推进器控制电极接近细胞,给予电极尖端约10-20 cmH2O的负压,使玻璃微管电极尖端与细胞间形成电-化学绝缘,阻抗达到10-100gΩ,即形成了细胞贴附式膜片(Cell-attached patch),将电极尖端提出液面于空气中暴露数秒,再放入浴槽,即形成内面向外式膜片(Inside-out patch)。

1.2.2.2 穿孔全细胞膜片钳实验

玻璃微管电极用微管电极拉制器(日本PC-10,NARISHIGE)两步拉制,电极尖端冲灌含二性霉素的全细胞电极液,阻抗约3-5 MΩ。在室温下,先形成细胞贴附式膜片(Cell-attached patch),约3-20min,可以看到膜电容出现并逐渐增大,而Rs则逐渐变小,提示穿孔膜片正在逐渐形成,20-30min后,膜电容瞬变值和Rs都趋于稳定,这时连续施加超极化脉冲,可观察到宏观电流,表明电极内液与细胞内液相通,穿孔全细胞膜片(Whole cell patch)完全形成[5]。

2 结果

2.1 人体肠系膜动脉平滑肌细胞应用于单通道膜片钳实验记录到的BKCa电流,如图1和图2所示。

图1 在inside-out patch下记录H型胶原酶法分离的人体肠系膜动脉平滑肌细胞 BKCa电流图

2.2 人体肠系膜动脉平滑肌细胞应用于穿孔全细胞膜片钳实验记录到的STOCs和BKCa电流[6],如图3所示。

3 讨论

单细胞越来越广泛的应用于科学研究的各个领域,相对于器官组织水平而言,单个细胞研究避免了神经体液调节的干扰,研究者可以随意改变细胞内外环境,研究药物浓度对细胞膜上各种离子通道的作用、细胞的跨膜信号转导及细胞的生物电现象等。而要得到较高质量的单个细胞是我们以上研究的必要前提条件,单个细胞的获取受到多种因素的影响,比如环境的温度、湿度、大气压、酶液的浓度、恒温水浴箱的温度、消化时间、组织块的大小等。为了获取较高质量的单个平滑肌细胞,笔者结合从事多年的电生理学研究经验,总结出以上三种不同的急性酶分离方法,均能成功的分离出单个人体肠系膜动脉平滑肌细胞,并有效的应用于电生理膜片钳实验中,且细胞封接稳定,记录电流的时间长,为单细胞的研究提供了实用而简便的方法,也为今后的科研工作奠定了坚实的基础。

1 杨艳,曾晓荣,刘智飞,等.酶分离猪冠脉平滑肌细胞钙激活钾通道全细胞记录电学特性研究[J].泸州医学院学报,2003,26(6)：473-476.

2 Yamamum H,Nagano N,Hirano M,et al.Activation of Ca2+dependent K+current by nordihydroguaiare acid in porcine co ronary arterial smooth muscle cells[J].J Pharamacol Exp T her.1999,29(1)：140-146.

3 Yang Y,Shui QL,Zeng XR,et al.Effects of neferine on potassium channels in guinea pig ventricular cells and porcine coronary artery smooth muscle cells[J].Chin J Pharma T oxico,2000,14(6)：405-410.

4 程俊,杨艳,曾晓荣,等.雌激素对人肠系膜平滑肌细胞钙激活钾通道的作用[J].黑龙江医学,2006,30(10)：749-752.

5 Cai F,Li PY,Yang Y,et al.Characteristic of spontaneous transient outward potassium currents in vascular smooth muscle cells of porcine coronary artery[J].Acta Phy siologica Sinica,2007,59(1)：27-32.

6 程俊,杨艳,曾晓荣,等.雌激素对正常人肠系膜血管平滑肌自发瞬时外向电流的作用[J].四川医学,2008,29(7)：797-799.