补肾健脾法治疗原因不明复发性流产临床研究*

李爱青 焦榕芳 刘洁 曾怡

（南昌大学第四附属医院 江西南昌330003）

生殖免疫学观点认为，妊娠是一种成功的半同种移植，而流产被设想为半同种移植的失败，妊娠的成功有赖于妊娠妇女对胚胎半同种抗原免疫耐受。近年来很多研究表明CD4+CD25+Tr细胞在人类体内对诱导和维持免疫耐受起着中枢作用[1]。现代中医临床和实验证明中医中药具有调节内分泌免疫等多系统功能，补肾健脾法为传统的安胎治法，临床证明切实有效。本研究观察补肾健脾对URSA患者治疗前后外周血CD4+CD25+Tr表达频率的变化，探讨补肾健脾中药在安胎治疗中发挥的免疫调节作用，为补肾健脾法安胎治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 URSA患者20例，2008年1月～2009年12月就诊于南昌大学第四附属医院，年龄（28.3±3.59）岁，中医辨证为脾肾两虚型。入选标准：(1)流产次数2次或2次以上。(2)夫妇双方和(或)胚胎染色体正常，无家族遗传病史。(3)妇科检查、超声检查和(或)子宫输卵管造影等检查排除器质性病变和生殖器官解剖畸形。(4)月经周期正常，基础体温双相，超声监测排卵正常。(5)男方精液分析正常。(6)性激素、甲状腺功能、空腹血糖、胰岛素等内分泌检查均正常。(7)排除生殖道感染性疾病，如假丝酵母菌、支原体、衣原体等感染。(8)自身抗体包括：抗核抗体(ANA)、抗可提取核抗原(ENA)抗体、抗心磷脂抗体(ACL)。(9)与血凝有关的检查：包括血小板聚集实验(PagT)、D-二聚体、血小板颗粒膜蛋白-140（GMP-140)、血凝系列、全血分析均正常。(10)巨细胞病毒、弓形虫等病原体检查为阴性。(11)全身免疫功能状态检查，包括IgG、IgM、IgA、C3、C4、CH50、B 因子均正常。

1.2 实验方法

1.2.1 服药及采血时间 孕前2个月开始服用补肾健脾中药（补肾固冲丸为基础方随证加减），月经周期第5天开始服药，20d为1个疗程，第3个月鼓励患者自然受孕，受孕后连续服药至孕3个月，B超显示有胎心胎动，随访至妊娠结束。服中药前及孕2个月时分别抽取患者外周血1mL进行流式细胞检测，治疗过程中失败者流产时抽血检测。

1.2.2 流式细胞检测方法 抽取外周静脉血1mL 48h内检测，取肝素抗凝血50μL加入CD4-PE(BD PharMingen,USA)及CD25-FITC(BD PharMingen，USA)各 5μL，混匀，室温下避光 15min；加入 1mL红细胞裂解液，混匀，室温下避光10min；以1 000r/min离心5min，弃上清，悬浮细胞，PBS液1mL洗涤；以1 000r/min离心5min，弃上清，悬浮细胞，上机检测。

2 结果

补肾健脾安胎后URSA外周血中CD4+CD25+Tr表达频率较治疗前明显升高，差异有显著性意义（P＜0.05），CD25+mean即 CD25+平均荧光强度差异无显著性（P＞0.05），CD4+CD25+/CD4+较治疗前升高（P＜0.05）。URSA患者中药治疗后，其中10例保胎成功，5例患者妊娠后再次流产，成功妊娠者CD4+CD25+Tr细胞表达频率显著高于妊娠失败者（P＜0.05）。见表1。

表1 20例URSA患者中药治疗前后CD4+CD25+Tr表达频率的比较 (±S)

表1 20例URSA患者中药治疗前后CD4+CD25+Tr表达频率的比较 (±S)

注：治疗前后比较，*P ＜0.05，△P ＞0.05。

CD4+CD25+(%) CD25+mean CD4+CD25+/CD4+20） 7.32±1.57 21.36±3.67 3.96±1.46治疗后（n=20） 11.23±3.58* 23.12±3.252△ 5.69±1.67*

3 讨论

随着生殖免疫学科的兴起，发展，中西医结合学者对流产的免疫学病因病理、诊断及治疗进行较为系统研究。复发性流产中医学属“滑胎”范畴，流产主要源于肾不载胎，脾失摄养，对流产的治疗除注重补肾外还必健脾益气，使脾与肾、先天与后天相互促进以固胎元。生殖免疫学角度的研究发现，补肾益气安胎中药可能通过双相调节Th细胞因子网络的平衡，来调控母胎界面免疫内分泌网络以维持妊娠[2]，补肾健脾药可以增强母胎保护性免疫功能，降低母胎损坏性免疫功能，调节内分泌，对妊娠细胞因子有着重要影响[3,4]。本研究着重从补肾健脾法入手，采用补肾固冲丸为基础方补肾健脾调冲任以安胎，方中菟丝子、续断、巴戟天、杜仲、鹿角霜补肾固冲；当归、熟地、枸杞、阿胶养肝滋血；党参、白术、大枣补脾益气；砂仁理气调冲：全方肾脾肝气血同治，使肾气壮实，胎有所系，气血充足，胎有所养，先天与后天相互支持，相互促进以益冲任之本。

近代生理免疫学研究发现，CD4+CD25+Tr细胞是机体以主动方式获得和维持自身免疫耐受的一种重要方式，Tr细胞可通过抑制自身反应性T细胞的免疫反应，抑制传统T细胞的活动以及促进一些抑制性细胞因子，在维持机体内环境的稳定、诱导移植物的耐受中发挥重要作用[5]。有研究报道，URSA和正常早孕妇女孕早期外周血CD4+CD25brightTr均显著高于正常未孕妇女，URSA患者外周血和蜕膜CD4+CD25brightTr均显著低于正常早孕妇女，CD4+CD25brightTr参与了正常妊娠的维持，有可能是调控母胎界面局部免疫耐受形成的一个重要因素[6]。人类调节性T细胞仅存在于CD4+CD25bright亚群，而CD4+CD25dimT细胞亚群主要是正常活化的T细胞[7,8]。本研究辨证采用补肾健脾法治疗脾肾两虚型URSA患者，通过检测治疗前后及不同妊娠结局外周血中CD4+CD25+Tr细胞的变化，发现补肾健脾中药安胎后，URSA患者血中CD4+CD25+Tr数量较治疗前明显升高（P＜0.05），且妊娠成功妇女CD4+CD25+Tr显著高于妊娠失败者（P＜0.05），CD25+平均荧光强度无明显变化，提示补肾健脾中药可能提高了外周血CD4+CD25brightTr细胞数量，降低了CD4+CD25dimTr细胞数量，参与了母胎免疫调控，增强母体保护性免疫，有利于维持内环境的稳定，从而维持了妊娠。

目前，对URSA的研究表明，该病与母胎外周系统免疫及母胎界面局部免疫密切相关，本研究仅从外周血中Tr细胞角度探讨补肾健脾治法对机体的免疫调节作用，对是否参与其他免疫环节的调控尚有待进一步研究。

[1]Baecher-Allan C,Viglietta V,Hafler DA.Human regulatory T cells[J].Semin Immunol,2004,16(2):89-98

[2]归绥琪,许钧,俞而慨,等.中药治疗自然流产对封闭抗体、β-HCG、孕酮、雌二醇的影响 [J].中国中西医结合杂志,1997,17(11)：645-648

[3]钟秀会,周占祥.黄芩白术对IPS诱导流产小鼠的保胎作用及子宫内膜TNF-α含量的影响[J].畜牧兽医学报,2000,31(5)：430

[4]蒋立辉,归绥琪.中药对溴隐亭流产大鼠保胎机理的实验研究[J].中国免疫学杂志,2002,18(10)：704-706

[5]Paust S，Cantor H.Regulatory T cells and autoimnmune disease[J].Immunol Rev,2005,204:195-207

[6]邱丽华,林其德.调节性T淋巴细胞与原因不明复发性流产相关性研究[J].中华妇产科杂志,2004,39(12)：816-820

[7]Baeche-Allan C,Brown JA,Freeman GJ,et al.CD4+CD25 high regulatory cells in human peripheral blood[J].J Immunol,2001,167(3):1 245-1 253

[8]Saito S,Sasaki Y,Sasaki M.CD4+CD25highregulatory T cells in human pregnancy[J].J Report Immunol,2005,65(2):111-120