P27、cyclin D1及膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义

詹自力 苟欣

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白P27和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在哺乳动物有丝分裂G1期转化到S期中起着重要调节作用，已有学者发现，在消化系肿瘤、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤中都存在P27的降低以及cyclin D1升高的现象。我们应用免疫组化法检测P27和cyclinD1在膀胱移行细胞癌中的表达情况，对P27、cyclin D1与肿瘤分期分级的关系，以及两种蛋白在膀胱癌中表达的相关性进行了探讨，现将有关资料报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择1992～2000年期间在我院施行膀胱部分切除术和全膀胱切除术，并经病理证实为膀胱移行细胞癌的石蜡标本65例，年龄32～82岁，平均65岁，男、女比例为5.5:1。非典型增生10例，年龄45～70岁，平均61岁，正常膀胱组织8例，年龄64～72岁，平均69岁。临床分期按TNM标准分为浅表性肿瘤Ta-T1：37例；侵润性肿瘤T2-T4：28例。病理分级按WHO法：I级20例，II级26例，III级19例。

1.2 方法 所用鼠抗人P27和cyclin D1单克隆抗体，以及SP免疫组化试剂盒均购自福州迈新公司。采用免疫组织化学染色SP法。石蜡切片常规脱蜡脱水，0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶30min，10%正常山羊血清封闭非特异性背景30min，依次加入一抗(鼠抗人P27、cyclin D1单克隆抗体，4℃过夜)，二抗(生物素化免抗鼠IgG，30min)，链霉素亲生物素蛋白过氧化酶10min，以上各步间均PBS缓冲液冲洗3次。DAB显色苏本素复染，常规脱水，透明封片。以已知P27和cyclin D1表达阳性的胃癌标本作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性反应。用高倍镜(10×40)计数10个视野，P27以大于50%的阳性细胞定为阳性[1]，阳性细胞数≤50%为阴性；cyclin D1以阳性细胞数＞5%定为阳性，阳性细胞数≤5%定为阴性[2]。采用双盲法阅片。

1.3 统计学方法 采用x2检验及精确概率法分析组间差异，Spearman相关分析两者相关性。

2 结果

2.1P27在膀胱癌，非典型增生和正常膀胱组织中的表达 正常膀胱组织P27阳性表达率为100%，显色位于细胞核；非典型增生标本中，P27阳性表达率为60%。在非典型增生组织中P27明显降低，有统计学意义(x2=4.114，P＜0.05)；膀胱癌组织中P27阳性表达率仅为52.3%，明显低于正常膀胱组织(x2=6.632，P＜0.01)。

2.2P27表达与膀胱癌分级分期的关系 I、II、III级膀胱癌标本P27阳性表达率分别为75%、53.8%、26.3%，三组间相比较，差别均有显著性意义(x2=7.603，P＜0.05)。应用x2分割法进一步比较每两组之间P27阳性表达水平的差别，I级与III级比较，有显著性意义(P＜0.01)。I级组与II级组、II级组与III级组相比较，无显著性差异(P＞0.05)。浅表组与侵润组相比较，有显著性差异(P＜0.01)。

2.3 cyclin D1在膀胱癌，非典型增生和正常膀胱组织中的表达 cyclin D1在正常膀胱组织中无阳性表达，在非典型增生中的阳性表达率为40%，明显升高，有统计学意义。膀胱癌中阳性表达率为38.5%，与正常组织相比，有显著性意义。

2.4 cyclin D1与膀胱癌分级分期的关系 I、II、III级膀胱癌cyclin D1阳性表达率为65%、34.6%、15.8%，三组间比较差别有显著性意义(x2=10.24,P＜0.01)。其中G1组与G2组(x2=4.182,P＜0.05)、G1组与G3组比较(x2=9.753,P＜0.01)，有显著性意义。G2组与G3组相比较，无显著性差异(x2=1.99,P＞0.1)。浅表组(Ta-T1)与侵润组(T2-T4)相比较，有显著性差异(x2=8.823，P＜0.01)。

2.5P27、cyclin D1在膀胱癌组织表达的相关性 本组65例膀胱癌中P27和cyclin D1同时表达阳性22例，占P27阳性的64.7%；P27和 cyclin D1同时表达阴性28例，占P27阴性的90.3%；P27表达阳性而 cyclin D1表达阴性12例，占35.3%，P27表达阴性而 cyclin D1表达阳性3例，占9.7%，P27与cyclin D1表达间呈正相关关系(r=0.565，P＜0.01)。

表1 P27、 cyclin D1在正常膀胱粘膜、非典型增生、膀胱癌表达

表2 65例膀胱癌P27 cyclin D1的表达与病理分级的关系

表3 65例膀胱癌P27 cyclin D1的表达与临床分期的关系

表4 膀胱癌中P27、 cyclin D1表达间的关系

3 讨论

3.1P27在膀胱移行细胞癌中表达的意义P27是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白家族成员之一，在细胞周期增殖和分化调控中起着非常重要的作用，是一种重要的肿瘤抑制基因。P27位于染色体12q13上，由198个氨基酸的残基组成[3]，在细胞增殖过程的G1/S转换中发挥作用,它可以特异性结合cyclinD-cdk4(cdk6)、cyclinA-cdk2及cyclinE2-cdk2等在S期具有活性的细胞周期素复合物及其单体,抑制cyclin/cdk复合物的活性,阻滞rb蛋白的磷酸化，对细胞周期进行负调节，与肿瘤的发生密切相关[4]。研究发现P27蛋白主要定位于细胞核，Surendra等[5]则发现P27在细胞核和胞浆中都有表达，而定位于胞核的P27抑制肿瘤的活性高。lindberg等[6]的研究发现P27基因突变在肿瘤的发生过程中是稀有事件,P27与肿瘤的关系主要体现在其蛋白水平上,表现为P27蛋白的减少或缺失。P27蛋白的下降，降低了P27对正性细胞周期调控蛋白的抑制效应,导致细胞增殖过度,发生肿瘤[7]。本研究发现在膀胱癌组织P27的阳性表达率(51%)，非典型增生组织中阳性表达率(60%)，明显低于正常膀胱组织(100%)，表明P27的低表达可能与膀胱癌发生有关。本组资料还显示病理III级的膀胱癌组织中P27的阳性表达率为26.3%，明显低于I级组的75%。同时侵润组阳性表达率(25%)也明显低于非侵润组(73%，P＜0.01)。这表明P27蛋白的表达程度与膀胱癌的恶性程度高低以及侵润性有关。

3.2 cyclin D1在膀胱移行细胞癌中表达的意义 cyclin D1是由位于11q13的CCND1基因编码的蛋白,由295个氨基酸组成,其相对分子量为34×103, cyclin D1的主要功能是促进细胞增殖，它在细胞周期中首先被合成，并在G1中期合成达高峰，与CDK4、CDK6结合形成二元复合物，使pRb蛋白磷酸化[8],pRb一旦磷酸化，其结合E2F的作用丧失，它激活细胞进入S期所需要的一些功能因子，使细胞由G1期进入S期，开始DNA的合成，细胞进入增殖状态[9]。研究发现肺非小细胞癌中cyclinD1常过表达，导致细胞周期启动异常,引起细胞持续性恶性增殖[10]。wang等[11]的研究表明cyclinD1与肺非小细胞癌的转移和预后不良有关，认为cyclinD1是肿瘤发生的晚期事件，可以作为判断肺非小细胞癌的预后指标之一。本研究发现cyclin D1在正常组织无表达，在10例膀胱非典型增生组织中，有4例cyclin D1阳性表达(40%)，与正常膀胱粘膜相比，差别有统计学意义；在65例膀胱癌中25例阳性表达(38.5%)，与正常膀胱粘膜相比，有显著性意义。这表明cyclin D1的过表达在膀胱粘膜增生的初期将发挥作用，这与Ogawa等的实验结论相同，他用尿嘧啶喂养小鼠4周以促进膀胱粘膜增生，从乳头状增生的膀胱粘膜中发现：cyclin D1明显高于对照组[12]。本实验结果证实， cyclin D1在膀胱癌G1、G2、G3组表达率分别为65%、34.6%、15.8%，依次递减，特别在G2和G3组出现明显下降，统计学上有显著性意义。其中，G1组与G2组间、G1组与G3组比较，有显著性意义，G2组与G3组间相比较，无显著性差异。浅表组(54.1%)与侵润组(17.5%)相比较，有显著性差异。这表明cyclin D1在细胞癌变的初始间段将发挥其促使细胞增殖的作用，但并不参与肿瘤的侵润和发展。

3.3P27和cyclin D1在膀胱癌中表达的相关性 cyclin D1是作用于G1期的重要细胞周期蛋白，在G1期与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)形成复合物，P27能够阻止cyclin D1与CDK4/CDK6结合，抑制cyclin D1-CDK4/CDK6的活性，使细胞不能进入S期，而cyclin D1则通过cyclin D1-CDK4/CDK6磷酸化P27调节其浓度。在结肠癌，食道癌等肿瘤中，随着肿瘤分级分期的增高，均出现P27的降低和cyclin D1的升高。而本实验显示：在P27表达阳性的34例膀胱癌标本中，有22例cyclin D1同时表达阳性；31例P27表达阴性标本中，28例cyclin D1同时表达阴性，二者表达符合率为65%，二者呈正相关(r=0.23，P＜0.01)，并且膀胱癌中随着肿瘤分级分期的升高，P27，cyclin D1表达均呈现同时下降趋势。P27阳性率与cyclin D1阳性率相比较，符合P27与cyclin D1-CDK4/CDK6结合发挥其调控细胞周期作用的学说。我们认为在膀胱癌发生的早期，pRb被内cyclin D1-CDK4/CDK6磷酸化后，解除对转录因子E2F释放的抑制效应，释放大量E2F，并产生一些功能因子，使细胞由G1期进入S期。此后cyclin D1在增殖中的作用已不大。由此可以看出膀胱癌P27、cyclin D1表达同时降低提示膀胱癌分化程度降低和侵润性的增高。

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