增损甘露消毒丹对肝纤维化大鼠肝组织MMP-1和 TIM P-1的影响

李长秦 孙守才 袁晓栋 马娟娟 王礼凤 郑旭锐 陕西中医学院 (咸阳 712046)

慢性病毒性肝炎,长久不愈均可致不同程度肝纤维化,早期的纤维化是可逆的,但到后期有再生结节形成时则不可逆转[1]。因此,阻止肝纤维化的形成与发展,对预防肝硬化甚至肝癌具有重要的意义。增损甘露消毒丹 (ZSGLXDD)经过长期、大量的临床使用和疗效检验,其治疗慢性肝炎、延缓肝纤维化进程的良好疗效已经得到肯定,是一个成熟并且安全有效的中药方剂。该方不仅具有抑制病毒复制及调整免疫功能的作用,而且具有保护肝细胞、修复肝损害、恢复肝功能、延缓肝纤维化进程等作用[2]。本实验研究旨在通过采用四氯化碳(CCL4)成功制备肝纤维化大鼠模型的基础上,应用免疫组化的方法测定各组大鼠基质金属蛋白酶-1(MM P-1)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIM P-1)的含量,从而探讨增损甘露消毒丹抗肝纤维化的作用机制。

1 实验材料与方法 1.1 实验动物 SD大鼠 63只,雄性,清洁级,体重(200±20)g,由西安交通大学医学院实验动物中心购进。动物合格证号:SCXK2007-001。

1.2 药物及试剂 CCL4分析纯:500mL/瓶,天津市致远化学试剂有限公司生产,批号:20070403。复方鳖甲软肝片(FFBJRGR):内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司出品 0.5g/片,生产批号:20070130,蒸馏水溶解为 0.625g/mL。 SP试剂盒:北京博奥森生物制品有限公司生产,批号:20081118。MM P-1,TIM P-1抗体:均为 0.1mL浓缩型,由北京博奥森生物制品有限公司生产,批号:20081118。增损甘露消毒丹由叶下株、连翘、苍术、丹参、僵蚕、姜黄等药物组成,购自陕西中医学院国医堂。药物经常规煎煮、过滤、水浴蒸发,浓缩至分别含生药 0.7g/mL、1.4g/mL、2.8g/mL的药液 ,置于 4℃冰箱保存备用。

1.3 动物模型制备[3]及分组 将实验大鼠适应性喂养 1周后,随机抽取 10只作为 A组(正常对照组)。其余大鼠实验第一天每只腹部皮下注射 40%四氯化碳植物油溶液 0.5mL/100g体重,以后每隔 3d皮下注射 40%四氯化碳植物油溶液 0.3mL/100g体重造模;再以 79.5%单纯玉米粉加 20%猪油、0.5%胆固醇制成的混合饲料喂饲;另以 30%乙醇为饮料饲养动物。从第 8周起每周末从造膜大鼠中随机处死 1只,作肝脏病理学检查,按照 2000年西安会议《病毒性肝炎防治方案》肝纤维化分期标准判断肝纤维化程度[4],直到有 2期以上肝纤维化形成,即确定造模成功。造膜结束死亡大鼠四只,将剩余大鼠随机分为 5组:B组 ,病理模型组 9只;C组 ,增损甘露消毒丹小剂量组 10只;D组,增损甘露消毒丹中剂量组 10只;E组,增损甘露消毒丹大剂量组 10只;F组,复方鳖甲软肝片组 10只。治疗给药:A组、B组用生理盐水灌胃 ,2mL/只,1次 /d,连续用药 8周。C组以增损甘露消毒丹 0.7g/100g体重灌胃 ,1次 /d,连续用药 8周。D组以增损甘露消毒丹 1.4 g/100g体重灌胃 ,1次 /d,连续用药 8周。 E组以增损甘露消毒丹 2.8g/100g体重灌胃,1次 /d,连续用药 8周。F组以复方鳖甲软肝片 0.625g/100g体重灌胃,1次 /d,连续用药 8周。

增损甘露消毒丹中剂量组、复方鳖甲软肝片组大鼠的给药剂量按成人常用剂量换算。增损甘露消毒丹小剂量组、增损甘露消毒丹大剂量组大鼠的给药剂量分别按增损甘露消毒丹中剂量组换算所得值的 1/2倍、2倍进行计算[5]。

1.4 观测指标及检测方法

1.4.1 一般行为表现:精神、活动、皮毛、饮食、粪便等。

1.4.2 常规病理学检查:将各组石蜡切片均作常规 HE染色,光镜观察肝组织病理变化程度。

1.4.3 免疫组织化学检测:将各组石蜡切片均作 M MP-1及 TIM P-1免疫组织化学染色,观察各组大鼠肝组织中 MM P-1及 TIM P-1的分布,并测定其表达。 (SP染色,DAB显色 ,均按试剂盒说明进行操作)。

2 实验结果 2.1 各组大鼠的行为表现 实验期间正常对照组大鼠饮食、活动及二便无明显变化,精神状态佳 ,皮毛正常有光泽。造模各组动物在注射 CCL4和酒精喂饲期间,所有大鼠均逐渐出现饮食及活动减少,时有稀溏便,个别腹部膨隆,精神不振,反应迟钝,皮毛凌乱缺乏光泽。各治疗组自用药起,随着时间的延长总体来说,大便逐渐正常,进食量、摄水量增加,精神状态亦随之好转。除增损甘露消毒丹小剂量组恢复情况一般外,其余各组大鼠均恢复较快。

2.2 各组大鼠肝脏组织 HE染色显微镜观察结果 正常对照组大鼠肝脏组织结构完整,肝细胞大小均匀,肝小叶结构清晰,小叶内肝细胞索排列整齐。病理模型组大鼠肝脏组织的正常结构破坏,肝细胞索排列紊乱,内含 2～ 3个中央静脉或 1个偏在边缘部的中央静脉,甚至没有中央静脉。小叶结构破坏,肝细胞有浊肿、变性、坏死、脂肪浸润。汇管区因纤维结缔组织增生而显著增宽,其中可见程度不等的炎性细胞浸润,并有小胆管样结构(假胆管)。增损甘露消毒丹小剂量组大鼠肝脏组织镜下观察结果与病理模型组基本相似。增损甘露消毒丹中剂量组、增损甘露消毒丹大剂量组、复方鳖甲软肝片组三个治疗组大鼠肝脏组织中均可见到一定程度的细胞变性,肝组织破坏程度、肝细胞坏死及脂肪变的程度均较轻,汇管区结缔组织增生不甚明显,总体状况较病理模型组明显好转。

2.3 各组大鼠肝组织 MM P-1的检测结果 与正常对照组比较,病理模型组显示肝组织中 MM P-1的表达增多,差异有统计学意义(P＜0.05)。增损甘露消毒丹小剂量组与病理模型组比较,肝组织中 MM P-1的表达,差异无统计学意义(P＞0.05)。增损甘露消毒丹中剂量组、增损甘露消毒丹大剂量组、复方鳖甲软肝片组三个治疗组与病理模型组比较,肝组织中MM P-1表达明显增多,差异有显著统计学意义(P＜0.01)。增损甘露消毒丹中剂量组、增损甘露消毒丹大剂量组、复方鳖甲软肝片组 3个治疗组之间比较,肝组织中 MM P-1的表达,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1:

表1 肝组织 MM P-1面积 /肝组织面积统计结果

2.4 各组大鼠肝组织 TIM P-1的检测结果 与正常对照组比较,病理模型组显示肝组织中 TIM P-1的表达明显增多,差异有显著统计学意义(P＜0.01)。增损甘露消毒丹小剂量组与病理模型组比较,肝组织 TIM P-1的表达,差异无统计学意义(P＞0.05)。增损甘露消毒丹中剂量组、增损甘露消毒丹大剂量组、复方鳖甲软肝片组三个治疗组与病理模型组比较,肝组织中 TIM P-1的表达明显降低,差异有显著统计学意义(P＜0.01)。增损甘露消毒丹中剂量组、增损甘露消毒丹大剂量组、复方鳖甲软肝片组三个治疗组之间比较,肝组织中 TIM P-1的表达,差异无统计学意义(P＞ 0.05)。见表 2。

表2 肝组织 T IMP-1面积 /肝组织面积统计结果

3 讨 论 肝纤维化是各种慢性肝病发展的必然阶段,是由于各种致病因子 (病毒、酒精、寄生虫等 )引起肝脏的损伤和炎症导致纤维组织广泛增生和沉积[7]。其本质是由于细胞外基质(ECM)合成与降解不平衡,导致 ECM过度沉积。在这个进行性的病理过程中,基质金属蛋白酶(MM Ps)及基质金属蛋白酶抑制剂 (TIMPs)起着重要的作用。本实验选取 MM P-1及TIM P-1这两个实验指标进行观察。MM P-1又称间质胶原酶,属胶原酶的一种,可将胶原纤维 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)分解,而肝纤维化时期细胞外基质(ECM)主要沉积物为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原。TIM P-1主要通过两方面促进肝纤维化发展:一方面通过抑制胶原酶 (MM P-1,MM P-8,MM P-13等)的降解活性,抑制间质性胶原为主的 ECM降解,导致纤维胶原沉积于细胞外;另一方面它可通过抑制激活的 HSC凋亡,从而持续产生 ECM和大量TIM P-1,如此产生的净效应导致大量纤维胶原越来越多地沉积于肝细胞外间质,而不能被胶原酶降解,从而加重纤维化乃至肝硬化[5]。

增损甘露消毒丹是我们经长期临床使用和疗效检验,治疗慢性病毒性肝炎、预防肝纤维化疗效肯定的经验方。通过本实验研究业已证实,增损甘露消毒丹可以增强肝纤维化大鼠肝组织 MM P-1的表达 ,抑制 TIM P-1的表达 ,从而能够促进肝内ECM的降解,因此对肝纤维化的治疗有疗效。所以,推测增损甘露消毒丹抗肝纤维化的机理可能是:①能够增强肝纤维化大鼠肝组织 M M P-1的表达 ,降低 TIM P-1的表达,从而促进肝纤维化的消退;②抑制 HSC的活化,促进 HSC的凋亡,降解 ECM等。

[1] 韩硬海 ,李树桐.临床肝脏病学 [M].山东:山东科学技术出版社,2004:172.

[2] 郝明霞.加味甘露消毒丹对慢性乙型肝炎血清HBV-DNA影响的临床研究[J].陕西中医,2007,28(1):14-16.

[3] 苗明三.实验动物和动物实验技术[M].北京:中国中医药出版社,1997:225-226.

[4] 陆伦根,曾民德,万谟彬,等.肝纤维化病理学分级分期及非创伤性诊断检测关系的初步研究 [J].肝脏,2000,5:194-197.

[5] 施新猷.现代医学实验动物学 [M].北京:人民军医出版社,2000:335.

[6] 褚云香.MM P-1,TIM P-1及其在肝纤维化中的作用 [J].国际消化杂志,2006,23(10):111-112.

[7] 高春芳,陆伦根.纤维化疾病的基础和临床 [M].上海:上海科学技术出版社,2004:265.