槲寄生碱抗胰腺癌作用的实验研究*

姚俊涛 王一羽 原 荣 李 军 孙 莉 胡玉琴 袁 彬 陕西省肿瘤医院(西安 710061)

胰腺癌是一种凶险的恶性肿瘤,近年发病有上升趋势,目前治疗包括以手术为主,放射治疗为辅的综合治疗,但是患者痛苦大 ,预后极差。槲寄生作为一种传统中药,具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎等作用。近年来研究发现,槲寄生是一种天然的抗肿瘤药物,但至今未见槲寄生生物碱与胰腺癌相关的研究。我们采用常规方法从槲寄生中提取生物碱,研究其对人胰腺癌细胞 PC-3的增殖、凋亡作用,并初步探讨其可能的机制,为胰腺癌的治疗提供理论依据和实验依据。

1 实验材料 1.1 细胞株 胰腺癌细胞株 PC-3购自第四军医大学细胞库。

1.2 药物 槲寄生药材经陕西省药品检验所鉴定。选用常规实验方法,主要从定性方面进行实验,先在酸性水溶液中浸泡粉碎后的槲寄生药材,然后再用碱性沉淀的方法提取出生物碱。具体过程为:选择槲寄生药材—粉碎—在酸性溶液中浸泡 48h—过滤—滤液加碱沉淀—出去不溶解部分—再加碱沉淀—其沉淀物即是总碱。在提取过程中,用不同碱度的溶液进行沉淀处理后,得到几种不同生物碱。将提取物以碘—碘化钾试剂、碘化汞钾试剂—检验均呈阳性反应,证明提取物均为槲寄生碱。

1.3 试剂 RPM I1640培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购于美国 Gibco公司;M TT为 Sigma公司产品。小鼠抗人 Bcl-2 FITC检测试剂、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒为 BD公司产品。氟尿嘧啶(5-FU)为上海旭东海普药业有限公司产品。其他试剂均为分析纯。

2实验方法 2.1 细胞培养 PC-3细胞用含 10%小牛血清的 RPMI1640培养液在 37℃、5%的 CO2条件下培养。 0.25%胰酶消化传代,2～ 3d更换培养。

2.2 M T T法药物敏感实验 取对数期生长的 PC-3细胞,调整细胞密度为 1×105个 /mL,铺到 96孔培养板培养,细胞贴壁后加入不同浓度的药物,并设定阴性对照 (不含药物,只含配置药物的乙醇),阳性对照 (含不同浓度的 5-FU),空白对照(不含细胞的培养液)。孵育 48h后,每孔加入 20 μl M T T液,继续 37℃孵育 4h后,吸去培养液,每孔加入二甲基亚飒 150μl,震动 10min后,在酶联免疫检测仪检测吸光度值(实验波长492nm,参考波长 620nm)。抑制率(%)=(未处理药物的 A492值-药物处理的 A492)/未处理药物的 A492值×100%。以药物对数浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,得出抑制 50%细胞生长的浓度(IC50)。

2.3 Bcl-2和细胞凋亡的检测 AnnexinⅤ -FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡。 PC-3细胞中分别加入 3个浓度组的槲寄生碱溶液,分别为 11.50,23.00,46.00μg/mL,另设阴性对照不加药组。药物作用 48h后 ,收集细胞,用 4℃预冷的 PBS洗细胞两次,用 250 μL结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为 1×106/mL;取 100μL的细胞悬液于 5mL流式管中,加入5μLAnnexin V/FITC和 10 μL 20ug/mL的碘化丙锭溶液;混匀后于室温避光孵育 15min;在反应管中加 400 μL稀释好的结合缓冲液,及时上流式细胞仪分析细胞凋亡。另取 100 μL细胞悬液,用含 70%乙醇的 PBS1mL渗透细胞 30min,冲洗 2次,弃上清。用 100 μL PBS重悬细胞,加小鼠抗人 BCL-2 FITC 5 μL,4℃下孵育 20min,加入 PBS,进行流式细胞仪检测。

2.4 统计学方法 采用 SPSS12.0统计学软件进行,实验组与对照组用 t检验。

3 实验结果 3.1 PC-3细胞对槲寄生碱的敏感性槲寄生碱对 PC-3细胞的生长有抑制作用,且抑制作用随碱浓度的升高而增加。当槲寄生碱的浓度为 92.00、46.00、23.00、11.50、5.75、2.88、 1.44、 0.72μ g/mL时 ,对 PC-3细胞的抑制率分别是(82.6±0.22)%、(81± 0.98)%、(70± 0.66)%、(59.4±1.34)%、(38.8±1.09)%、(34.5±2.01)%、(17.6±1.24)%、(8.1±1.12)%。槲寄生碱对 PC-3细胞的 IC50为 8.64 μg/mL,阳性对照 5-FU的浓度为 50.00、25.00、 12.50、6.25、 3.13、1.56、0.78、 0.39μ g/mL时 ,对 PC-3细胞的抑制率分别是 (97.6±1.02)%、(92.5±0.79)%、(77.2±0.23)%、(62.5±0.79)%、(45.2±1.22)%、(12.4± 1.42)%、(5.2±2.00)%、(0.3±1.35)%。 5-FU对 PC-3细胞的 IC50为 4.59μg/mL。

3.2 槲寄生碱对 Bcl-2表达的影响 与没有加入槲寄生碱的 PC-3细胞相比 ,加入槲寄生碱的细胞 Bcl-2表达率明显降低(P ＜0.05),并且降低程度随槲寄生碱剂量的升高而增加。未加入槲寄生碱的 PC-3细胞 Bcl-2的表达率是(72.56±0.98)%,当槲寄生碱的浓度为 11.50、 23.00、46.00 μg/mL时 ,PC-3细胞的 Bcl-2表达率分别是(30.26±1.02)%、(21.76±0.87)% 、 (16.41± 1.11)%(见图 1)。

3.3 槲寄生碱对细胞凋亡的影响 与没有加入槲寄生碱的 PC-3细胞相比,加入槲寄生碱凋亡率明显增加(P＜0.05),并且凋亡率随槲寄生碱剂量的升高而增加。未加入槲寄生碱的 PC-3细胞凋亡率是(0.84±0.81)%,加入槲寄生碱的浓度为 11.50、23.00、46.00μg/mL时,PC-3细胞的凋亡率分别是(25.20± 1.23)%、 (39.24± 0.66)%、 (68.61± 1.10)%(见图2)。

4 讨 论 胰腺癌是消化系统具有高度恶性的肿瘤,起病隐蔽,不易早发现,进展迅速 ,手术切除率仅 15%,5年生存率不足 4%,严重威胁人类健康,且发病率在我国呈逐年上升趋势。胰腺癌治疗仍然以手术为主,放化疗为辅的综合治疗。副作用大且预后极差。所以积极寻找治疗胰腺癌的新方法成为当务之急。

槲寄生属植物为桑寄生科半寄生常绿小灌木,是中国的传统中药,其成分主要有:槲寄生凝集素、槲寄生毒素、生物碱、黄酮类化合物等,具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、免疫调节、抗骨质疏松、降血压、降血糖等药理作用。近年来发现槲寄生还具有抗肿瘤的作用,叶孟,林蕾等报导槲寄生对 HCT116细胞的生长有明显抑制作用,并使人大肠癌细胞 HCT116周期阻止在 G2/M期[1],并可以通过抑制 NF-κBp活性来诱导人大肠癌HCT116细胞凋亡[2]。郭艳杰报导槲寄生生物碱可能通过对抑癌基因 P53表达来抑制人肝癌细胞株 SMM C-7721的生长[3]。李亚娟发现槲寄生碱可以抑制人腺样囊性癌细胞 ACC的生长、增殖[4]。

在欧洲,槲寄生已被作为一种有效的抗肿瘤辅助治疗应用于临床。现在市场上出售的成品药剂主要有 Iscador,Eurixor,Helixor,Isorel等。做为有效的辅助治疗手段。关于槲寄生在肿瘤治疗中的应用研究及其机制仍在不断展开中,Gardin NE将槲寄生应用于肿瘤患者,两周后对比测患者用药前后的白细胞计数、CD4+和 CD8+T淋巴细胞、补体 C3和 C4、免疫球蛋白A、G和 M等指标,证实槲寄生能够提高肿瘤患者的细胞免疫和体液免疫应答[5]。Seifert G报道槲寄生在体外通过诱导细胞凋亡杀伤急性淋巴细胞白血病细胞细胞系 NALM-6,并在小鼠体内实验获得了同样的结果,显著提升了小鼠的存活时间,并且没有发现任何副作用[6]。Sabova L发现槲寄生提取物不但能够抑制 Jurkat细胞的生长,诱导其凋亡,而且与阿霉素具有协同杀瘤作用[7]。Wode K等报道了槲寄生提取物能够对抗肿瘤相关疲劳(Cancer-related fatigue,CRF),提升患者的生活质量,并且呈现出剂量依赖效应[8]。本实验通过 M TT方法测得槲寄生碱对胰腺癌细胞 PC-3的 IC50为 8.64 μg/mL,5-FU对PC-3细胞的 IC50为 4.59 μg/mL。 结果表明槲寄生对 PC-3细胞的生长有抑制作用。

Bcl-2家族是调节细胞凋亡的重要调节因子,主要定位于核膜,内质网和线粒体外膜。Bcl-2基因表达能够阻断多种细胞凋亡途径的共同通道,抑制凋亡,增加细胞染色体畸变和病毒感染机会,导致细胞恶变和促进肿瘤的发生发展。Bcl-2表达于多种实体肿瘤,如乳腺癌,结肠癌 ,肺腺癌、卵巢癌等,在胰腺癌中也有较高的表达率。并且影响肿瘤细胞的凋亡和对放化疗的抵抗[9]。 Okamoto K等用特异的 Bcl-2 siRNA使 Bcl-2基因沉默,能够在体外提高胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性[10]。本研究用流式细胞术检测槲寄生碱对 PC-3细胞的凋亡率和 Bcl-2的表达,结果显示随着槲寄生碱作用浓度的增大,细胞凋亡率越来越高,Bcl-2表达率越来越低,各组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。表明槲寄生能够能够促进胰腺癌细胞的凋亡,并且对 Bcl-2有明显的抑制作用。降低 PC-3细胞中 Bcl-2的表达可能是其促进细胞凋亡的原因。

本研究证实槲寄生碱抑制胰腺癌癌细胞 PC-3增殖,其诱导凋亡的机制可能与干扰下调凋亡相关蛋白 Bcl-2的表达有关。作为一种分布广、造价低廉、毒副作用的天然药物,槲寄生在胰腺癌治疗领域有良好的临床应用前景,但其具体机制仍需进一步研究。

[1] 林 蕾,叶 孟,王少敏,等.槲寄生通过抑制 N F-κ B活性来诱导人大肠癌 HCT116细胞凋亡 [J].中国临床药理学与治疗学,2008,13(7):730-734.

[2] 李亚娟,周洪澜 ,葛 岩,张丽红,等.槲寄生碱对人腺样囊性癌细胞的抑制作用 [J].吉林大学学报(医学版),2008,34(4):601-604.

[3] 郭艳杰,周立社,孔凡青,等.槲寄生生物碱通过P53途径抑制肝癌细胞株 SMMC-7721的研究[J].包头医学院学报,2008,24(3):227-229.

[4] 叶 孟,林 蕾,王少敏,等.槲寄生对人大肠癌HCT116细胞细胞周期作用的研究 [J].现代实用医学,2007,19(10):780-784.

[5] Gardin N E.Immunological response to mistletoe(Viscum album L.)in cancer patients:a four-case series[J].Phytother Res,2009,23:407-411.

[6] Seifert G,Jesse P,Laengler A,et al.Molec μlar mechanisms of mistletoe plant extract-induced apoptosis in acute lymphoblastic leukemia in vivo and in vitro[J].Cancer Lett,2008,264:218-228.

[7] Sabova L,Pilatova M,Szilagyi K,et al.Cytotoxic effect of mistletoe(Viscum album L.)extract on Jurkat cells and its interaction with doxorubicin[J].Phytother Res,2010,24:365-368.

[8] Wode K,Schneider T,Lundberg I,et al.Mistletoe treatment in cancer-related fatigue:a case repor[J]t.Cases J,2009,2:77.

[9] Mortenson MM,Galante JG,Gilad O,et al.BCL-2 functions as an activator of the AKT signaling pathway in pancreatic cancer[J].J Cell Biochem,2007,102:1171-1179.

[10] Okamoto K,Ocker M,Neureiter D,et al.bcl-2-specific siRNAs restore gemcitabine sensitivityin human pancreatic cancer cells[J].JCell Mol Med,2007,11:349-361.