虎杖苷对非酒精性脂肪肝大鼠保护作用及机制研究

张 霖 陈育尧 孙学刚 吕志平 南方医科大学中医药学院 (广州 510515)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,N AFLD)是遗传-环境-代谢应激相关因素所致,以肝细胞内脂肪堆积为主的病理综合征,随着社会经济发展,N AFLD患病率迅速增高,现已成为危害人类健康的三大肝病之一,其与胰岛素抵抗及其相关的代谢综合征和遗传易感性密切相关[1],临床尚无理想的治疗药物。中药虎杖,苦、平,功能祛风、利湿、破瘀、通经[2]。古今医家多利用虎杖单用或配伍治疗脂肪肝,尤其对于湿热型胁痛、黄疸。虎杖苷是虎杖的主要活性成分之一,本文主要研究虎杖苷对非酒精性脂肪肝模型大鼠的保护作用,并从虎杖苷对 N AFLD模型大鼠胰岛素抵抗(IR)的影响角度探讨其可能作用机制。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物:健康雄性 SD大鼠 44只,体重 200± 10g,SPF级,由南方医科大学实验动物中心提供(合格证号:0035578)。

1.1.2 药物及试剂:虎杖苷(98.63%,HPLC,购自江苏南京泽朗医药科技有限公司),非诺贝特(国药准字H31021491,批号 070310,购自南方医科大学附属南方医院)。胆固醇购自广州威佳生物科技有限公司,ELISA试剂盒购自广东达晖生物科技有限公司,猪油购于广州加益食品有限公司,大鼠基础饲料由南方医科大学实验动物中心提供,高脂饲料由南方医科大学实验动物中心加工生产。

1.2 方法 1.2.1 动物模型的建立和分组:健康雄性SD大鼠 44只,体重 200±10g,SPFA级,称重后分笼喂养,每笼 4只,标号,饲养于南方医科大学中医药学院实验动物中心。正常喂养 1周后,随机分为 2组 ,正常组 (A)和模型组 (M),正常组给予标准饲料,模型组给予高脂饲料(高脂饲料配制:10%猪油+2%胆固醇+88%标准饲料)喂养,8周后,分别从正常组和模型组随机挑选一只,取肝脏做病理切片,证实非酒精性脂肪肝形成。再将模型组随机分为 5组:空白模型组(B)、虎杖苷高剂量组 (C1)、虎杖苷中剂量组(C2)、虎杖苷低剂量组(C3)、非诺贝特组(D),每组 7只,组间大鼠体重差异无显著性 (P＞0.05)。正常对照组以标准饲料喂养,其余高脂饲料喂养。喂养期间,实验动物自由饮水和进食,动物房保持安静,自然采光,温度 25℃左右。喂养持续 8周。

1.2.2 给药:8周后,A组、B组予以生理盐水灌胃,5mL/次 ,C1、 C2、 C3分别 以 160mg/kg.d、80 mg/kg.d、 40 mg/kg.d虎杖苷混悬液灌胃,D组以 100mg/kg.d非诺贝特混悬液灌胃。持续 4周。

1.2.3 标本采集:从造模开始算,第 12周末当晚大鼠禁食不禁水 12h,次日上午称重后,用 10%水合氯醛以 0.35mL/100g浓度腹腔注射麻醉,腹主动脉取血 8mL,4℃,3000rmp离心 10min,分离血清。 -20℃保存。迅速提取肝脏,称重,4℃生理盐水冲洗,在肝右叶离边缘 1cm处,横切一块肝组织用 10%中性福尔马林固定,常规脱水,石蜡包埋 ,HE染色。

1.2.4 指标检测:①肝脏大体性状观察,光镜下病理切片观察;②血脂、肝功能全自动生化分析仪分析;③空腹胰岛素 (FN S):放免法测定,将样本血清与抗血清混合反应,在加入标记抗原进行竞争性结合反应,反应完全后,加入 PR免疫分离剂,分离出抗原抗体混合物,测定复合物的放射性(B),计算各标准管的结合率(B/B0%)。做出标准曲线,查出样品浓度;空腹血糖(FBG):采用酶法,严格按试剂盒说明书操作;计算胰岛素抵抗指数 (IRI)= FBG×FN S/22.5,胰岛素敏感指数 (ISI)=1/(FBG×FNS);

2 结 果

2.1 肝脏大体性状观察 正常组大鼠肝脏包膜光滑完整,表面颜色暗红 ,光润,中等硬度,边缘锐利,切面细颗粒感,无油腻感。模型组大鼠肝脏均表面发黄,肝脏体积明显增大,包膜紧张。虎杖苷组肝脏较正常组偏大,但比模型组明显减小,大部分颜色暗红、润泽,切面无油腻感。中小剂量组肝脏普遍增大,色淡黄,切面油腻感。非诺贝特组体积稍增大,色暗红,部分切面油腻感。

2.2 肝脏病理观察(见附图)正常组肝细胞肝小叶结构清晰,肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状分布,胞浆呈均匀一致的红染状态,肝窦清晰可见,肝索排列整齐。模型组肝细胞肿胀,部分肝细胞呈气球样变。多数肝细胞内可见大小不等,数量不一的脂滴空泡,肝索排列紊乱。虎杖苷组有显著的改善,其脂肪滴与模型组明显减少,密度稀,肝窦清晰,肝索排列整齐 ,无炎性细胞浸润。非诺贝特组明显脂肪变性,脂肪滴胶模型组小,密度稍稀,肝细胞肿胀,排列不整齐。

2.3 各组大鼠 ALT、AST比较 模型组大鼠 ALT高于正常组(P=0.01),高剂量组显著低于模型组(P=0.007),且与非诺贝特组存在显著差异(P=0.034),中剂量组低于模型组(P=0.031),非诺贝特组与模型组无差异(P=0.569),见表 1。

表1 虎杖苷对各组大鼠肝功能的影响(±s)

表1 虎杖苷对各组大鼠肝功能的影响(±s)

注:与正常组比较△P＜0.05,▲P＜0.01;◇ P＜0.05,◆P＜0.01与模型组比较;□ P＜0.05,■P＜0.01与西药对照组比较。下列表注与此相同。

组 别 n ALT(U/L) AST(U/L)A 7 41.57± 6.106 113.00± 13.940 B 7 53.8± 12.061△ 139.57± 27.922 C1 7 40.86± 6.568◆□ 116.71± 17.792 C2 6 43.33± 5.785◇ 109.83± 19.843 C3 7 47.57± 6.425 115.57± 11.414 D 6 51.17± 11.268 134.83± 34.008

2.4 各组大鼠 T G、TC、LDL-C、HDL-C比较 模型组TG、TC、LDL-C、HDL-C与正常组差异均有统计学意义(P=0.033,0.044,0.013,0.026),高剂量组与模型组 TG、TC、LDL-C、HDL-C差异均有统计学意义(P=0.00024,0.031,0.009,0.001),且在 TG方面与非诺贝特组存在显著差异(P=0.002)。非诺贝特组在 TG、LDL-C、HDL-C方面与模型组存在显著差异(P=0.003,0.029,0.0004)。 见表 2。

2.5 各组 FBG、FNS、IR、ISI比较 模型组 FBG、FNS、IR、ISI与正常组差异均有统计学意义(P=0.000,0.002,0.001,0.000),高剂量组与模型组各项均存在显著差异(P=0.000,0.000,0.001,0.000),与非诺贝特组比较在 FBG、IR、ISI方面有显著差异(P=0.000,0.000,0.001)。见表 3。

表2 虎杖苷对各组大鼠 T G、TC、LDL-C、HDL-C比较(±s)

表2 虎杖苷对各组大鼠 T G、TC、LDL-C、HDL-C比较(±s)

组 别 n TG(mmol/L) TC(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-L(mmol/L)A 7 0.597± 0.111 0.863± 0.080 0.414± 0.041 0.437± 0.042 B 7 0.754± 0.093△ 1.094± 0.422△ 0.491± 0.056△ 0.351± 0.052△C1 7 0.464± 0.162◆ 0.844± 0.124◇▲ 0.410± 0.033## 0.487± 0.052◆C2 6 0.522± 0.195◇ 0.933± 0.122 0.438± 0.062 0.440± 0.078◇C3 7 0.623± 0.117 0.947± 0.125 0.514± 0.054 0.367± 0.051 D 6 0.523± 0.087◆ 1.238±0.136 0.422±0.078◇ 0.502± 0.120◆

表3 虎杖苷对各组大鼠胰岛素抵抗的影响(±s)

表3 虎杖苷对各组大鼠胰岛素抵抗的影响(±s)

组 别 n FBG(mmol/L) FIN(Uiu/mL) IR ISI A 7 4.814± 1.300 7.871± 0.622 1.674± 0.418 0.028± 0.005 B 7 11.857± 1.875▲ 12.097± 1.498▲ 6.406± 1.403▲ 0.007± 0.002▲C1 7 4.057± 0.597◆■ 8.780± 1.112◆ 1.579± 0.290◆■ 0.029± 0.005◆■C2 6 8.350± 0.622◆ 9.697± 0.881◇ 3.591± 0.352◇ 0.012± 0.001◇C3 7 10.357± 0.720 11.724± 1.462 5.408± 0.841 0.008± 0.001 D 6 8.833± 0.731◆ 10.077± 0.773◇ 3.954±0.411◇ 0.011± 0.001◇

讨 论 近年来的研究发现,在正常体重、糖耐量、血脂的人群中也可发生 N AFLD,但通过高胰岛素正常葡萄糖钳夹试验等方法发现 N AFLD患者几乎都存在 IR,提示 NAFLD与 IR之间存在明显的相关性。

N AFLA多由过食肥甘厚味,导致湿热蕴藉中焦,临床以胁痛、黄疸、肥胖、舌苔厚腻 ,脉弦滑为特征,属中医 “胁痛”、“肥胖”、“黄疸”等范畴。中药虎杖,苦、平,功能利湿退黄、破瘀,是临床治疗“胁痛”、“肥胖”、“黄疸”的常用药物。本实验表明,虎杖苷作为虎杖的其中一种重要活性成分,能降低模型大鼠血脂水平,改善肝功能,保护肝细胞。机制研究表明虎杖苷能显著改善模型大鼠体内胰岛素抵抗。由此推测虎杖苷可能通过改善胰岛素抵抗 ,增加大鼠体内对胰岛素的敏感性,减少脂肪动员,减轻或解除肝细胞氧化超载,从而降低血脂、改善肝功能,保护肝细胞,从而达到治疗非酒精性脂肪肝的作用。虎杖苷在虎杖根部的含量高达 1.231%,且提取分离简单,随着药效和作用靶点的明确,具有很广阔的开发前景。我们将进一步深入研究虎杖苷改善 IR状态的分子机制,并从多角度研究其治疗 NAFLD的机制,为从中草药中开发治疗 N AFLD的药物寻找科学依据。

[1] Seung HP,Byung IK,Sang HK,et al.Body fat distribution and insulin resistance: beyond obesity in nonalcoholic fattyliver disease amongoverweight men in American College of Nut rition,2007,26(4):321-3261.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典 [M].上海:上海科学技术出版社,2005:1329.