排毒双调综合疗法对肾切除 CRF大鼠血浆 AngⅡ和 ALD影响的实验研究

董正华 张 楠 李小会 赵天才 曾福海 陕西中医学院 (咸阳 712046)

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)是由多种慢性肾脏疾病或累及肾脏的全身性疾病引起的慢性进行性肾实质损害。我们根据多年研究,提出并“排毒双调综合疗法”治疗CRF的思路,并取得较好临床效果[1]。为进一步从实验学角度证实该疗法的作用并且从血管活性因子及盐皮质激素角度探讨其作用机制,特设计本实验。

1 实验材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物:SD系健康雄性大鼠,体重 200±20g,共 72只。

1.1.2 实验用药:①灌胃方:西洋参、制附片、白术、茯苓、黄连、苏叶等;②灌肠方:酒大黄、制附子、煅龙骨、蒲公英等。药物经常规煎煮、过滤、水浴蒸发分别至每毫升含生药材 1.3g、2.6g,置 4℃冰箱备用;大鼠用量按文献方法[2]折算。

1.1.3 主要实验试剂:血清 BUN、Scr试剂盒,南京建成生物工程研究所出品;血浆 AngⅡ、ADL试剂盒,购自北京科美东雅生物技术有限公司。

1.2 实验方法 1.2.1 实验分组及造模:大鼠购回后,适应性喂养 1周,称体重,经尿蛋白定性检查为阴性后,随机抽取 8只作为正常对照组(A组),其余 64只造模成功后随机分为 5组。参照文献方法[2],对 64只大鼠行两期手术法造成 5/6肾切除 CRF模型,8只对照组大鼠同步进行两期假手术。

1.2.2 喂养及给药方式:第Ⅱ期手术后,经过 3周模型成型期,共死亡大鼠 9只。将剩余 55只模型大鼠随机分为病理组(B组),灌胃组(C组),灌肠组(D组 ),针刺组(E组),综合治疗组即灌胃+灌肠+针刺组(F组)。各组大鼠分别给予如下处理:A、B两组分别给予生理盐水 2mL灌胃,1mL灌肠,四处非穴位针柄按压。 C组予灌胃方 2mL灌胃,生理盐水 1mL灌肠,四处非穴位针柄按压。D组予生理盐水 2mL灌胃,灌肠方 1mL灌肠,四处非穴位针柄按压。E组分别给予生理盐水 2mL灌胃,1mL灌肠 ,针刺脾俞、肾俞、足三里、三阴交。 F组予灌胃方2mL灌胃,灌肠方 1mL灌肠,针刺脾俞、肾俞、足三里、三阴交。

上述治疗共持续 4周,灌胃、灌肠、针刺每日各 1次,针刺穴位按文献方法[3]定位。

1.2.3 标本采集及观测指标:观察各组大鼠精神状态、反应性、活动度、摄食情况、毛色、体重变化、二便情况及存活数等。治疗结束后,停药禁食 24h,禁水 8h,称取大鼠体重;颈总动脉采血 2mL,用毛细吸管吸取 50μl血液测 Hb,离心后取血清检测 BUN、Scr;颈静脉采血 3mL,离心后取血浆测 AngⅡ、ALD含量。剥离残肾 ,10%的甲醛溶液固定,石蜡包埋,病理切片。

1.3 统计学方法 使用 SPSS12.0for windows统计软件,所有数据均以均数±标准差±s表示,采用单因素方差分析法对实验结果进行统计学分析。

2 结果与分析 2.1 一般状况 从造模到分组开始时,共死亡大鼠 9只,其中第Ⅰ期手术后死亡 4只,第Ⅱ期手术后死亡 5只。从给药开始到实验结束,B组死亡 3只,存活 8只;C组死亡 2只,存活 9只;D组死亡 3只,存活 8只;E组死亡 3只,存活 8只;F组死亡 2只,存活 9只。 A组全部存活,精神状况、反应性、活动度良好,皮毛光泽、进食及二便正常,体重增加明显;B组精神萎靡,活动迟缓,摄食减少 ,皮毛蓬松无光泽 ,明显消瘦、体重下降 ,耳廓、尾巴苍白,小便量少、大便稀溏;各治疗组大鼠精神均较好,较活泼,摄食一般,耳廓、尾巴较红润,皮毛较有光泽,大便尚成形,小便量轻度增多,以 F组一般状况的改善最佳。

2.2 治疗前后大鼠体重变化 见表 1。

表1 治疗前后各组大鼠体重变化比较(±s)

表1 治疗前后各组大鼠体重变化比较(±s)

注:△表示与 A组比较 P＜0.01▲表示与 B组比较 P＜0.01◇表示与 C组比较 P＜0.01□表示与 D组比较 P＜0.01■表示与 E组比较 P＜0.01◆表示与 F组比较 P＜0.01。表 2相同

组 别n(只) 5周末体重(g) n(只 ) 治疗后体重(g)A(空白 ) 8 258.70± 5.96 8 322.32± 9.35 B(病模 )11 215.63± 9.32△ 8 199.94± 8.45△C(灌胃 ) 11 218.54± 10.08△ 9 223.67± 9.53△▲◆D(灌肠 )11 220.61± 7.01△ 8 225.21± 9.47△▲◆E(针刺 ) 11 220.22± 6.03△ 8 214.20± 8.92△▲◆F(综合 ) 11 215.76± 5.05△ 9 247.16± 9.91△▲◇□■

2.3 治疗后各组大鼠肾功、血红蛋白(Hb)含量 见表 2。

表2 治疗结束后各组大鼠肾功、血红蛋白值比较(±s)

表2 治疗结束后各组大鼠肾功、血红蛋白值比较(±s)

组 别 n BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) Hb(g/L)A(空白 )8 4.76± 0.89 73.50± 17.25 147.98± 8.18 B(病模 )8 14.71±1.18△ 150.11± 8.86△ 46.42± 9.94△C(灌胃 )9 9.11± 1.33△▲◆□ 129.93± 7.10△▲◆ 69.65± 10.21△▲◆D(灌肠 )8 8.00±0.77△▲◆ 131.26± 6.44△▲◆◇ 58.42± 7.76△▲◇◆E(针刺 )8 12.52±1.45△▲◆□ 140.50± 5.40△▲◆□ 55.51± 4.70△▲◇◆F(综合 )9 6.79±0.95△▲◇ 112.85±5.48△▲ 88.44±8.11△▲

2.4 治疗后各组大鼠血浆血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )、醛固酮(ALD)含量 见表 3。

表3 治疗结束后检测各组大鼠血浆AngⅡ、ALD值比较(±s)

表3 治疗结束后检测各组大鼠血浆AngⅡ、ALD值比较(±s)

注:△表示与 A组比较 P＜0.01◇表示与 F组比较 P＜0.05▲表示与 B组比较 P＜0.01或 P＜0.05

组 别 n(只 ) AngⅡ (pg/mL) ALD(ng/mL)A(空白 ) 8 174± 24.60 0.27± 0.06 B(病模 ) 8 616± 90.80△ 0.40± 0.11△C(灌胃 ) 9 489± 58.50△▲◇ 0.33± 0.06▲D(灌肠 ) 8 514± 85.50△▲◇ 0.38± 0.09△◇E(针刺 ) 8 550± 75.70△◇ 0.38± 0.09△◇F(综合 ) 9 401± 50.66△▲ 0.30± 0.07▲

2.5 肾脏病理学观察 A组肾脏外观及光镜下肾小球、肾小管及肾间质结构正常。 B组残肾体积明显增大,混浊无光泽,表面凹凸不平,呈结节状,质地坚硬。光镜下肾小球系膜区明显增宽,系膜细胞及系膜基质增多,毛细血管变窄,肾小囊轻度增厚,部分肾小管上皮细胞肿胀、变性,管腔变小 ,肾小管腔内可见蛋白管型,肾间质有局灶性纤维组织增生,有大量散在炎症细胞浸润。 C组残肾体积增大,颜色黯淡,质地较硬,与 B组比较程度较轻。部分肾小球系膜区轻度增宽,系膜细胞及系膜基质增多,部分肾小球毛细血管变窄,可见部分肾小管腔内有蛋白管型,肾小管上皮细胞变性,部分肾间质纤维组织增生及少量散在炎症细胞浸润。D、E、F组外观及光镜下大体上同 C组。惟 F组个别肾小球系膜区轻度增宽,个别肾小球毛细血管变窄,肾小管腔内可见少量蛋白管型,部分肾间质轻度纤维化,偶见少量炎症细胞浸润。

3 讨 论 3.1 排毒双调综合疗法的提出 CRF是慢性肾脏疾病发展到晚期,脏腑衰败、正气虚竭,水饮、湿热、瘀血等浊毒蓄积体内的疑难重症。临床实践认为其病理特点是本虚标实,本虚以气血阴阳亏损、脏腑功能虚衰为主;标实以水湿、瘀浊等毒邪为患。由于病情复杂,任何单一疗法都难以奏效。针对 CRF的病机特点,以提高临床疗效为目的,我们提出“排毒双调综合疗法”治疗 CRF的思路。“排毒”指通过汗液、二便等多种途径祛除体内蓄积之水湿、瘀浊等毒邪;“双调”是调补气血阴阳之虚衰,调理脏腑功能之紊乱。“排毒双调综合疗法”,即综合应用内服、外敷、灌肠、针灸等多种治疗措施,从不同途径排出蓄积于体内的毒邪,调补气血阴阳,调理脏腑功能,充分发挥各种疗法的优势,最大限度地提高临床疗效。

3.2 排毒双调综合疗法治疗 CRF的疗效分析 本课题以往临床研究证实,该疗法对 CRF患者具有改善临床症状 ,保护残余肾功能,延缓肾衰进展的功效[1]。实验研究亦证实,该疗法能明显抑制 TNF-α、TGF-β在肾组织中的过度表达,能有效改善细胞凋亡的调控;调整肾组织内 SOD、MDA及 ET的活性,升高肾组织 PA蛋白的表达,降低肾组织 PAI蛋白的表达,有效维持纤溶系统平衡状态,减轻 CRF肾组织纤维化程度 ,延缓 CRF病程进展,并较单一疗法为佳[4～7]。

本实验结果显示,单纯中药汤剂灌胃、灌肠、针刺及综合疗法对 CRF都有一定的治疗效果。在改善模型大鼠的一般状况,阻抑体重下降,升高 Hb、纠正贫血,降低血 BUN、Scr、改善肾功,延缓 CRF大鼠肾脏病理改变等方面 ,综合疗法明显优于单一疗法。

3.3 排毒双调综合疗法对 5/6肾切除 CRF模型大鼠血浆 AngⅡ、ALD的影响 肾小球硬化 (GS)、肾小管及间质纤维化是 CRF的主要病理变化。血浆中 AngⅡ和 ALD在该过程中具有重要意义。顾氏检测 36例肾间质纤维化患者血浆中的AngⅡ和 ALD,显示患者血浆中的 AngⅡ和 ALD含量均升高,且呈正相关关系[8]。AngⅡ不仅是一种血管活性因子,影响肾脏血流动力学,而且还是一种生长因子和促纤维化因子,影响肾脏固有细胞的生物学功能,促进其纤维化形成。 AngⅡ在慢性肾脏疾病的发生发展过程中起着重要作用,它直接通过影响血流动力学和间接影响细胞生长因子的作用,最终导致 GS,肾小管萎缩及肾间质纤维化直至肾功能衰竭。

ALD是体内的盐皮质激素,主要参与电介质和水液代谢,AngⅡ与之关系密切。 AngⅡ通过促进肾上腺皮质球状带细胞合成和分泌 ALD,从而增加钠、水重吸收,使血容量和血压增高。近年研究证明 ALD还作为独立的因素参与了肾、心、肝、肺等器官组织的纤维化。研究发现,多种肾衰竭动物模型和临床 CRF患者均存在高醛固酮血症[8,9]。ALD是有丝分裂和胶原合成的强烈刺激物,可以促进肾脏纤维化[10]。ALD也是慢性肾脏疾病进展中的一个独立致病因素,它可通过血压和直接的细胞作用造成肾损伤,ALD受体拮抗剂能够有效的降低血压,减少蛋白尿,延缓肾脏疾病进展,与 ACEI共同保护残肾功能[11]。

本实验结果显示:模型大鼠血浆 AngⅡ和 ALD含量显著升高,与文献报道相吻合[8,9];经各种中医措施治疗四周后,各组大鼠血浆 AngⅡ、ALD含量均有不同程度降低,综合疗法组降低幅度最大;结合残肾病理观察,确实起到了延缓模型大鼠GS和肾间质纤维化的作用。综合疗法对模型大鼠起到较明显的治疗效果,发挥了保护肾功能,延缓病理进展的作用。其作用机制可能与降低血浆 AngⅡ和 ALD水平,影响肾脏血流动力学,减少水钠潴留,拮抗肾小球硬化和肾间质纤维化而延缓肾损害的进展有关。

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