山仙颗粒含药血清对大鼠 S-180肉瘤细胞 fas基因表达的相关性研究*

常燕飞 方 艳 应小平 西电集团医院(西安 710077)

实验材料 1.1 实验动物及瘤株 健康 SD大 10只(雌、雄各半 ),6～ 8周龄,体重 250± 5g,由第四军医大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(军 )2002-005;S-180肉瘤瘤株,购自第四军医大学实验动物中心。

1.2 主要药品、试剂及仪器 山仙颗粒(SXG):由陕西中医学院附属医院制剂中心提供(生产日期 090328),按中药人、鼠剂量换算标准换算后,按小鼠 4g/kg/d(临床等效剂量 10倍)给药,配置比例为山仙颗粒(g):生理盐水(mL)为 1∶2,即配成0.5g/mL的混悬液。

主要试剂:fas单克隆抗体(Santa Cruze公司),二步法免疫组化检测试剂盒 PV6002、DAB显色剂(北京博奥森生物技术有限公司)。

主要仪器:超净工作台 (苏州净化设备厂),电子称(上海第二分析仪器厂),水平离心机(LD-42型,北京医用离心机厂),电热恒温培养箱(上海医疗器械厂,HH◦ B11◦ 420),倒置显微镜(尼康 TS100),光学显微镜(尼康 DXM1200F)

2 实验方法 2.1 大鼠血清的制备 2.1.1 大鼠山仙颗粒剂含药血清制备:正常 SD大鼠随机抽取 5只 ,体重 250±5g,按中药人、鼠剂量换算标准换算后 ,按小鼠 4g/kg/d(临床等效剂量 10倍)给药,配置比例为山仙颗粒(g):生理盐水(mL)为 1∶2,即配成 0.5g/mL的混悬液,于上午 9点及下午 3点各 1次,连服 7d后,于末次给药后 2h后 3%戊巴比妥钠 0.15mL/100g-1腹腔注射麻醉,,颈动脉取血,离心取血清,56℃、30min灭活补体 ,除菌过滤后,-20℃分装冻存。

2.1.2 正常大鼠血清制备:正常 SD大鼠随机抽取 5只,体重 250±5g,灌胃等量生理盐水 ,方法同上。

2.2 S-180肉瘤细胞体外培养 采用 M TT法,S-180细胞用含青霉素 G100U◦ mL-1、链霉素 100mg◦ L-1及 10%小牛血清的 RPM I1640培养液稀释成 5×105◦ mL-1瘤细胞悬液,向6孔细胞培养板每孔加入 1800μL瘤细胞悬液;对照组加入200 μL小牛血清 ,空白 1组加入 200 μL正常 SD正常大鼠血清,空白 2组加入 20 μL正常鼠血清及 180 μL小牛血清,用药 1组(大剂量组)加 200 μL鼠含药血清;用药 2组(小剂量组 )加入20 μL鼠含药血清及 180 μL小牛血清;每一浓度设 3复孔。37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。

2.3 实验结果检测 2.3.1 于 24h、48h、72h分别收集S-180培养细胞,离心沉淀,检测其 Fas蛋白的表达:采用免疫细胞化学 SP(Histostain-Plus)法:将收集的 S-180培养细胞铺片,常规水化,PBS洗片 5min×3次,0.3%H2O2(用甲醇稀释)室温处理 10min以封闭内源性过氧化物酶,PBS洗片 5min× 2次;将其浸入 0.01mol/L、ph6.0柠檬酸盐缓冲液中,微波 III档(98℃)10min× 2次,自然冷却 ,约 20min;PBS洗片 3min× 3次;加入 Fas兔抗鼠多克隆抗体(1∶ 100),4℃、湿盒过夜;PBS洗片 3min×3次;加入生物素化羊抗兔第二抗体(1∶200),37℃、40min;PBS洗片 3min×3次;加入封闭液 1∶200稀释的Streptavidin-HRP,37℃、30min,PBS洗片 3min× 3次;0.04%DAB+0.03%H2O2显色,10min,充分水洗 5min;苏木素衬染1min,水洗蓝化;常规脱水、透明,中性树胶封片。每例标本随机选取 10个高倍镜视野(400×),计算阳性细胞百分率 ,根据阳性细胞的百分率及染色强度计算评分。①阳性细胞数:＜5%为 0分,5%～ 25%为 1分,25% ～ 50为 2分,50%～ 75%为3分,＞75%为 4分。②染色强度:0分为无染色,1分为淡黄色,2分为黄色,3分为棕黄色 /棕褐色。③两者乘积＞1分为阳性,≤1分为阴性。

2.3.2 统计学方法 采用使用 SPSS软件进行统计学分析。

结 果 各组 S-180肉瘤细胞 fas表达水平的测定情况,见表 1。

表1 各组 S-180肉瘤细胞 fas表达水平的测定表

表明:SXG含药血清能上调 S-180肉瘤细胞中的 fas表达水平。

结 论 细胞凋亡(apoptosis)也叫程序性细胞死亡(programmed cell death),属细胞的主动死亡。但当细胞受到某些外界因素作用时,其代谢与调节过程改变,出现 DNA断裂等变化,从而产生凋亡。凋亡过程受一系列基因调控,其中 Fas是位于细胞膜上的细胞凋亡基因受体(亦称为 CD95APO-1),Fas与其天然配体 Fas L(Ligand)构成 Fas系统 ,二者结合后即出现凋亡信号,导致表达 Fas的细胞发生凋亡[1]。 Fas和 Fasl是一种免疫防御系统,有人称 Fas和 Fasl为一组抑癌基因。当Fas与 Fasl的表达或功能异常时,可导致 Fas系统信号破坏,不能进行正常的诱导凋亡作用,从而使异常细胞逃避了机体的免疫监视,发展成恶性肿瘤即可逃逸其凋亡[2]。故恶性肿瘤的发生、发展可能与 Fas丢失,逃避通过 Fas/FasL系统的清除作用有关。Fas/Fasl的深入研究显示:Fas/FasL在肿瘤细胞上表达是随着肿瘤恶性程度的提高,Fas的表达下调,FasL的表达上调。因此 ,肿瘤的 Fas表达明显下降或丢失、FasL的高水平表达可能是肿瘤发生并持续发展的重要机制之一。Husain等[3]研究发现,FasL阳性的肿瘤细胞更易发生转移或转移后更易生长。刘晓红等[4]发现 ,FasL上调与乳腺癌肿瘤大小、淋巴结转移、乳腺癌临床分期密切相关。另外 Fas/FasL的表达情况还有重要的预后意义。 Lee等[5]经过研究后提出,肝癌细胞 FasL表达是影响肝癌术后患者预后的一个独立因素,FasL阳性者存活时间明显短于阴性者。由此可见,了解肿瘤细胞 Fas/FasL表达的情况,对于预防、发现、诊断、治疗肿瘤具有重要意义。

中药复方制剂是中医治疗肿瘤的重要手段,是中医辨证论治理论在临床应用的体现,因而在肿瘤临床治疗上占有重要位置。复方中药制剂山仙颗粒,组方选用具有高效益气活血、软坚散结、调理脾胃作用的中药如西洋参、龟版、鳖甲、莪术、仙鹤草、生山楂等以达益气活血的主要功效。经以往的临床观察及动物实验研究表明,该方可提高机体抗肿瘤免疫、明显改善临床症状;它有抑瘤、抗转移、防复发作用[6]。本实验结果表明、免疫组化结果显示山仙颗粒含药血清大剂量组组能明显上调体外培养的 S-180肉瘤细胞中促凋亡基因 fas的表达,其机制可能是调控肿瘤细胞凋亡促凋亡基因 fas的表达,调节 Fas/Fasl系统,从而诱导 S-180肉瘤细胞的凋亡而实现的。

[1] NagataS,GolsteinP.The Fas Death Fact or Science,1995,267(10):1449-1456.

[2] OconnellJ,O'sullivanGC,Collins JK,etal.The Fas counter attack:Fas-mediatecl Tcecl killinghy colon cancer cells expressing ligand Expmed.1996,184:1075-1082.

[3] Husain N,ChioccaEA.Co-expression ofFas and Fas ligand inma-lignant glial tumors and cell lines[J]. Acta Neuropathol Ber,l1998,95(3):287-290.

[4] 刘晓红 ,王心明,王延龄.Fas/FasL在乳腺疾病发生发展过程中作用的研究[J].中华实验诊断学,2007,11(2):158-162.

[5] Lee WC,Yu W C,Chen M F.Prognostic impact of Fas ligand onhepatocellular carcinoma after hepatectomy[J].World J Surg,2004,28(8):792-796.

[6] 王希胜,陈光伟,李宏庭,等.山仙颗粒治疗恶性肿瘤 56例 [J].陕西中医,2002,23(9):778-779.