流式细胞术检测 VEGF在急性冠状动脉综合征诊断中的应用

黄 山,许 健,令狐颖,刘志琴,袁 军

近年来,随着社会老龄化进程的加快,以及不良生活方式和饮食习惯的存在,冠心病的发病率和病死率也急剧增加,已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)是迄今发现的具有特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子,在促进血管生成、再生和抗动脉硬化及治疗中发挥着重要的作用,是评价动脉粥样硬化病程发展和治疗效果评价的一个重要指标。为了了解 VEGF在心脏疾病中的诊断价值,我们利用流式细胞分析技术 (flow cytometer,FCM)对其进行了检测,旨在为临床相关疾病的诊断提供依据,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源 血浆标本采自2009年 9月—2010年 3月贵州省人民医院心内科住院病人和健康体检者,清晨空腹采血,分离血清,-80℃保存待检。急性冠状动脉综合征病例组共 75例,其中男 40例,女 35例,平均年龄 (52.5±17.3)岁。所有病人均符合 1997年 WHO诊断标准,其中稳定性心绞痛 25例,不稳定型心绞痛 25例,急性心肌梗死 25例,正常对照组为各项体检指标均正常的健康人群,共 25例,其中男 10例,女 15例,平均年龄 (42.7±16.9)岁。

1.2 主要试剂和仪器 VEGF试剂盒流式检测 (批号 51-9004276,美国 BD公司),VEGF标准品 (批号 558336,美国BD公司,浓度 2500ng/L),BD Aria流式细胞仪 (美国 BD公司)。

1.3 检测方法 对健康照组、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和心肌梗死各 25例血清标本,按照试剂盒说明书和 BD Aria流式细胞仪的操作规程进行检测,将标准品稀释作标准曲线进行定量。

1.4 统计学方法 应用 SPSS12.0版统计软件进行统计分析,计量资料采用 t检验,以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

病例组 VEGF为 (344.4±99.6)ng/L,对照组为 (78.1±18.7)ng/L,差异有统计学意义 (P＜0.05)。不同病例 4组两两比较,差异均有统计学意义 (P＜0.05,见表1)。

表1 4组 VEGF检测结果Table1 The result of VEGF

3 讨论

VEGF最初是在肿瘤细胞分泌物中发现的,具有高度的血管渗透性,主要由内皮细胞、单核巨噬细胞、成纤维细胞产生[1],是迄今发现的具有特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子,不仅能诱导血管新生,而且能增加血管通透性,可以促进巨噬细胞和单核细胞向动脉粥样硬化斑块内迁移,在促进血管生成、再生和抗动脉硬化及治疗中有着重要的意义。VEGF在不同的病理生理变化过程中扮演的不同角色也与VEGF的浓度相关,正常心脏只表达少量 VEGF[2],健康受试者血浆中游离 VEGF的浓度非常低。同时,在心血管病防治中,VEGF水平的高低还被认为是评价动脉粥样硬化病程发展和治疗效果评价的一个重要指标。实验表明:心肌缺血时,VEGF表达增加,提示缺血和缺氧刺激 VEGF表达增加[3]。说明缺血和缺氧是刺激 VEGF表达增加的重要因素,而缺血和缺氧恰恰是冠状动脉综合征不可逾越的重要环节。本研究显示,VEGF在对照组及冠心病组的含量有显著的差异,同时,其浓度在稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和心肌梗死时是逐渐增加的,显示不同类型的冠心病之间差异均有统计学意义,这对冠状动脉综合征的诊断具有一定临床应用价值。

目前,在临床上使用较为广泛的心脏标志物主要是一些诊断价值已经临床证实的确诊标志物,如肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶及其同工酶、利钠肽等,而其他一些标志物如炎症因子、细胞黏附分子等,也可用于心肌缺血的早期诊断和急性冠状动脉综合征危害因素评估。但由于其检测方法在临床实际应用上还存在一些有待解决的问题 (如临床特异性、检测方法的特异性和敏感性、检测的标准化、是否适合于常规检测实验室操作等),这些心脏标志物还未能在临床上大规模应用,还需得到更多的临床研究证实[4]。为此,我们采用 FCM检测VEGF,目的也在于对不同的 VEGF检测方法进行探索,为VEGF的检测提供常规外的另一种选择。

在 VEGF的检验中,方法较多,常用的有酶联免疫吸附试验、放射免疫试验、免疫比浊等,但这些方法存在线性较窄,可比性差、干扰因素多等缺点。近年来,流式细胞分析技术(Flow Cytometer,FCM)已广泛应用于临床,并且应用前景不断扩大,对此,我们利用 FCM进行了检测。从传统意义上讲,流式细胞术只能检测细胞及其表面抗原,而近年发展起来的流式微球分析技术 (cytoometric bead assay,CBA)则是将液体中的可溶性成分结合在一种类似于细胞大小的颗粒上,便可用FCM检测,其工作原理是,首先将包被某种抗体的不同大小和荧光强度的微球与待测样品溶液混合,微球上的特异性抗体就与样品中相应的抗原或蛋白结合,再加入荧光素标记的二抗,形成 “三明治”夹心复合物,用流式细胞仪检测抗体的荧光信号就能定量可溶性被检物。与传统方法比较,CBA所需样本量更少,并大大缩短操作时间,同时其特异性强,灵敏度高,可实现多参数分析,其应用领域越来越广,值得在临床上推广。

1 Senger DR,GalliSJ,PerruzziCA,etal.Tumor cells secretea vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid[J].Scinence,1983,219(4587):983-985.

2 Risau W.Mechanisms of angiogenesis[J].Nature,1997,386(6626):671-674.

3 Cmalan,Mittals,Kumcrs,et al.Arandatized comparison of sublugual and vaginalin isoprostal for cervical prim ing before sution termination of first trinester pregnancy[J].Contraception,2004,70:11.

4 潘柏申.应重视心脏标志物的临床应用研究 [J].中华检验医学杂志,2005,28(9):881-884.