SPR传感器在食品微生物检测中的应用

刘 霞，李宗军*

(湖南农业大学食品科学技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

SPR传感器在食品微生物检测中的应用

刘 霞，李宗军*

(湖南农业大学食品科学技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

表面等离子体子共振 (SPR)是一种新兴的现代分析技术，它不仅可以实时监测分子间相互作用，还可以准确、灵敏、快速、简便的检测出各种生化指标。利用SPR检测食品中的微生物是近年来兴起的一个热门课题。本文简单介绍了SPR的基本原理，综述了SPR在食品微生物中应用的研究进展。

表面等离子体子共振；生物传感器；食品中微生物；检测

表面等离子体子共振 (surface plasmon resonance，SPR)是一种基于物质折射率变化的动态﹑无标记的现代检测手段，具有高识别性、高灵敏性、快速、原位(无需标记)、便捷、实时、芯片可重复使用等优点，已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号传导、受体配体、癌症研究和新药筛选等生命科学领域[1-3]。近年已出现了多种模式的SPR分析仪，其样品池由单通道发展到多通道，检测方式由点检测发展到成像(表面等离子共振成像，SPRI)检测，应用范围也由生命科学领域扩展到食品、环境、材料等领域。目前，SPR已成功的测定食品中营养物、细菌和真菌、药物残留等物质，随着食源性疾病的频繁爆发，各种食源性致病菌及其毒素已成为SPR检测的主要目标[4]。

1SPR基本原理

SPR检测是一种利用表面等离子体波(surface plasmon wave，SPW)进行检测的技术。表面等离子体(SP)是沿着金属和电介质间界面传播的电磁波形成的。当平行表面的偏振光以称之为表面等离子体共振角入射在界面上发生衰减全反射时，入射光被耦合入表面等离子体内，光能大量被吸收，在这个角度上由于表面等离子体共振引起界面反射光显著减少。由于SPR对金属表面电介质的折射率非常敏感，不同电介质其表面等离子体共振角不同。同种电介质附在金属表面的量不同，则SPR的响应强度不同。基于这种原理的生物传感器通常将一种具特异识别属性的分子即配体固定于金属膜表面，监控溶液中的被分析物与该配体的结合过程。在复合物形成或解离过程中，金属膜表面溶液的折射率发生变化，随即被SPR生物传感器检测出来。

2 SPR在食品微生物检测中的应用

近年来，随着国内外口蹄疫、疯牛病、禽流感、“瘦肉精”等重大食品安全事故的相继爆发，食品安全问题已成了全球关注的焦点，特别是食源性致病菌导致的食源性疾病已是当代全球食品安全面临的巨大威胁。食品的安全问题不仅直接关系到人类的健康生存，

也严重影响到经济的发展和社会的稳定。传统检测微生物的方法操作繁琐、耗时，已不再适应现代社会发展的需要，SPR生物传感器为解决这一问题提供了新的技术平台。

2.1 细菌病原体

2.1.1 大肠杆菌O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7，E. coli O157∶H7)

自1998年Fratamico等[5]应用SPR生物传感器检测了大肠杆菌O157∶H7之后，许多研究报道了E.coli O157∶H7的SPR检测。Oh等[6]将E.coli O157∶H7的单克隆抗体固定在蛋白G修饰的商业化SPR传感器芯片表面，直接检测E.coli O157∶H7的检测限为104cells/mL。随后，他们将同样的抗体固定在巯基烷烃修饰的传感器芯片表面，使用同样的仪器直接检测E.coli O157∶H7的检测限可达到102cells/mL[7]。Taylor等[8]应用波长检测型SPR传感器研究了芯片表面不同修饰方法对传感器性能的影响，将单克隆抗体固定在巯基烷烃修饰并氨基偶联化后的芯片表面，引入含有E.coli O157∶H7的溶液，然后再引入多克隆抗体作为二抗，分别检测了细胞溶解后的细菌、热处理的细菌和未处理的细菌，其检测限分别为1 04、105、106CFU/mL。Meeusen等[9]报道了应用Spreeta SPR传感器检测E.coli O157∶H7，将生物素化的E.coli O157∶H7多克隆抗体固定在亲和素修饰的芯片表面，检测E. coli O157∶H7可达到8.7×106CFU/mL，耗时35min。葛晶等[10]利用大肠杆菌抗体的免疫吸附反应，使用集成化手持式Spreeta SPR传感器快速检测大肠杆菌E.Coli O157∶H7，采用亲和素-生物素系统放大检测的响应信号，并引入复合抗体作为二次抗体，使该传感器对大肠杆菌的检测限由106CFU/mL下降到105CFU/mL。

Taylor等[11]应用多通道的波长检测型SPR传感器，采用三明治的方法检测了苹果汁中的E.coli O157∶H7。他们首先在传感器芯片表面修饰了乙烯基乙二醇的巯基烷烃，将其生物素化后，引入链霉亲和素，让其与芯片表面的生物素充分结合后，再将生物素化的E.coli O157∶H7多克隆抗体固定在芯片表面，分别检测了缓冲液、4种细菌的混合液及苹果汁中的E.coli O157∶H7。此外，他们还研究了苹果汁的pH值对传感器信号的影响，研究结果表明，苹果汁的pH值为7.4时的SPR信号比pH值为3.7的SPR信号强，在pH7.4的缓冲液和苹果汁中检测E.coli O157∶H7的检测限为1.4×104CFU/mL。Waswa等[12-13]分别应用Biacore 2000和便携式Spreeta SPR传感器检测了E.coli O157∶H7。先将Biacore 2000的芯片表面自组装一层羧甲基葡聚糖，将其氨基偶联化，再引入蛋白A，然后将E.coli O157∶H7抗体流经传感器表面，与蛋白A结合，使其固定在传感器芯片表面，直接检测巴氏消毒牛奶中的E.coli O157∶H7，检测限为25CFU/mL[12]；而应用Spreeta传感器，则将生物素化的E.coli O157∶H7抗体固定在亲和素修饰的芯片表面，检测牛奶、苹果汁和牛肉中E.coli O157∶H7的范围均在102～103CFU/mL[13]。Joung等[14]采用肽氨酸提高灵敏度的方法检测了大肠杆菌O157∶H7的16S rRNA。

2.1.2 沙门氏菌(Salmonella enteritidis，S. enteritidis)

2001年，Koubova等[15]报道了应用波长检测型SPR传感器检测S.enteritidis。将S.enteritidis抗体固定在戊二醛交联的芯片表面，直接检测了热处理和乙醇浸泡过的S.enteritidis，其检测限为106CFU/mL。Oh等[16]使用商业化的SPR传感器检测了鼠伤寒沙门氏菌，先在芯片表面自组装了一层巯基烷烃，再将蛋白G固定在传感器表面，然后将鼠伤寒沙门氏菌抗体固定在芯片表面，直接检测鼠伤寒沙门氏菌的检测限为102CFU/mL。随后，他们使用同样的仪器和同样的方法检测了副伤寒沙门氏菌，检测限也为102CFU/mL[17]。王凯等[18]使用集成化手持式SpreetaTMSPR传感器快速检测沙门氏菌，他们利用亲和素-生物素系统保证检测的准确性；利用沙门氏菌抗体的免疫吸附反应，保证结果的特异性；并引入复合抗体作为第二抗体以扩大检测的响应信号，检测到鼠伤寒沙门氏菌的浓度为105CFU/mL，耗时1h。

Waswa等[12]应用Biacore 2000SPR传感器检测了牛奶中S.enteritidis。先将传感器的芯片表面自组装一层羧甲基葡聚糖，将其氨基偶联化，再引入蛋白A，然后将S.enteritidis抗体流经传感器表面，与蛋白A结合，使其固定在传感器芯片表面，直接检测巴氏消毒的牛奶中的S.enteritidis，检测限为23CFU/mL。2007年，Mazumdar等[19]也报道了用商业化的SPR仪器，采用三明治的方法检测牛奶中的沙门氏菌。先将其多克隆抗体固定在硅烷修饰的憎水芯片表面，再将感染了鼠伤寒沙门氏菌的牛奶流经传感器芯片，培育15min，然后再将二抗流经传感器芯片进行检测，其检测限为105cells/mL。最近，Mazumdar等[20]应用SPR直接检测了被沙门氏菌污染的猪血清，其检测下限为67.5μg/mL。

2.1.3 单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，L. monocytogenes)

Koubova等[15]报道了L. monocytogenes的SPR检测，他们应用的是波长检测型SPR传感器。将L.monocytogenes的抗体固定在戊二醛交联的芯片表面，直接检测了热处理的L. monocytogenes，检测限为107cells/mL。Leonard等[21]则用B i a c o r e 3 0 0 0，采用竞争模式检测了L.monocytogenes。他们先将多克隆抗羊抗体固定在经过氨基偶联的羧甲基葡聚糖修饰的芯片表面，并将已知浓度的L.monocytogenes和兔抗李斯特菌的抗体混合培育一段时间，让其充分结合后，离心将细胞-抗体复合物与

自由的抗体分离，将含有自由抗体的溶液流经SPR芯片进行检测，其检测限可达到105cells/mL。Taylor等[11]应用多通道的波长检测型S P R，检测了苹果汁中的L. monocytogenes。检测方法与他们检测E.coli O157∶H7的相同，在p H 7.4的缓冲液和苹果汁中检测L. monocytogenes的检测限大约为3×103CFU/mL。

2.1.4 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni，C. jejuni)

Taylor等[11]应用多通道的波长检测型SPR，检测了苹果汁中的L.monocytogenes。检测方法与他们检测E.coli O157∶H7的相同，在pH7.4的缓冲液和苹果汁中检测L.monocytogenes的检测限分别为1×105CFU/mL和5×104CFU/mL。

2.1.5 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus a ureus，S. aureus)

2006年，Subramanian等[22]使用SR 7000，采用直接法和三明治法检测了S. aureus，检测限分别为107CFU/mL和105CFU/mL。Balasubramainan等[23]则使用溶解性噬菌体作为生物识别元素检测了S.aureus。将噬菌体吸附在Spreeta SPR传感器芯片表面，直接检测S.aureus的检测限为104CFU/mL。

2.1.6 结肠炎耶尔森杆菌(Yersinia enterocolitica，Y. enterocolitica)

Oh等[24]报道了Y. enterocolitica的SPR检测。他们先在传感器芯片表面自组装了巯基烷烃，再将蛋白G偶联在巯基烷烃表面，然后将Y. enterocolitica的单克隆抗体固定在传感器芯片表面，检测Y. enterocolitica的检测限为102CFU/mL。

2.1.7 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

Jyoung等[25]同样用检测Y. enterocolitica的仪器和方法检测了霍乱弧菌O 1，在缓冲液中的检测限为4× 105CFU/mL。

2.2 寄生虫(Protozoan parasite)

2006年，Kang等[26]报道了隐孢子虫卵囊的SPR检测。他们将Biacore 2000传感器芯片表面组装了一层巯基烷烃，并将链霉亲和素偶联在其表面，然后将生物素化的隐孢子虫卵囊单克隆抗体固定在传感器表面，在缓冲液中检测隐孢子虫卵囊的检测限为106卵囊/mL。

2.3 真菌病原体(Fungal pathogen)

Zezza等[27]应用Biacore X，采用DNA杂交的方法检测了小麦中的大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)。从样品中提取出含有Fusarium culmorum的特异性DNA片段，扩增后，注入固定有与其互补的DNA序列的传感器芯片表面，进行检测，其检测限为0.25ng/μL。在30ng硬质小麦中，最小可检测出特异性Fusarium culmorum DNA 0.06pg。

2.4 毒素(Toxins)

在食品安全中涉及到的毒素主要是由细菌、真菌和藻类产生的。

2.4.1 葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B，SEB)

2000年，Nedelkov等[28-29]应用Biacore X，采用直接法检测了SEB。将SEB抗体固定在经过氨基偶联后的羧甲基葡聚糖修饰的芯片表面，直接检测了牛奶和蘑菇中的SEB，检测限可达到1ng/mL。随后，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测了同样的样品，其结果与SPR结果一致。2002年，Slavík等[30]使用光纤SPR传感器检测了SEB，他们将SEB抗体吸附在戊二醛交联的芯片表面，直接检测缓冲液中的SEB，检测限为10ng/mL。Homola等[31]使用波长检测型SPR传感器检测了缓冲液和牛奶中的SEB，将多克隆SEB抗体固定在经过氨基偶联的巯基烷烃修饰的芯片表面，在缓冲液直接检测SEB的检测限为5ng/mL，三明治法检测缓冲液和牛奶中SEB的检测限为0.5ng/mL。2003年，Medina等[32]应用竞争模式检测了SEB，将SEB固定在传感器芯片表面，含有SEB的样品和已知浓度的SEB抗体培育20～30min，离心分离，将上层液(未结合的抗体)流经传感器进行分析检测，在牛奶中的检测限为0.3ng/mL。检测一个样品仅需要15min。

2.4.2 葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A，SEA)

Medina等[33]应用Biacore 1000，采用竞争的实验方法检测了生鸡蛋中的SEA。首先将SEA固定在经过氨基偶联的羧甲基葡聚糖修饰的芯片表面，将生鸡蛋溶液混合均匀后离心，取其上清液并加入SEA抗体，待其与样品中的SEA充分结合后离心分离，将上层液(未结合的抗体)注入传感器芯片，使用这样的方法，在整个鸡蛋中检测SEA的检测限为1ng/mL。

2.4.3 软骨藻酸(domoic acid，DA)

Lotierzo等[34]应用Biacore 3000检测了DA，将分子印迹聚合物光接枝在芯片表面作为识别元素，以竞争的实验方法检测了DA，在缓冲液中的检测限为5ng/mL。2005年，Yu等[35]应用SPR传感器检测了DA，他们在缓冲液中的检测限为0.1ng/mL。Traynor等[36]报道了贝类提取物中DA的SPR检测，他们将DA固定在经过氨基偶联的羧甲基葡聚糖修饰的芯片表面，以竞争的实验方法检测了蚌类、牡蛎和小贝壳中的DA，检测限分别为1、4.9μg/g和7μg/g。Stevens等[37]应用便携式的Spreeta 2000传感器检测了DA，将多克隆DA抗体固定在缩氨酸修饰的芯片表面，检测缓冲液和蛤俐中的DA，检测限为3ng/mL。

2.4.4黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1)

2000年，Daly等[38]成功的应用Biacore 1000检测了aflatoxin B1，aflatoxin B1被固定在经过氨基偶联的羧甲基葡聚糖修饰的芯片表面，以竞争的实验方法进行检测，在缓冲液中的检测限为3ng/mL。Dunne等[39]使用单链抗体(scFvs)作为识别元素检测了aflatoxin B1，对于单体scFvs和二聚体scFvs作为生物识别元素，在缓冲液中的检测限分别为375pg/mL和190pg/mL。

2.4.5 脱氧雪腐镰刀菌醇(deoxynivalenol)

deoxynivalenol 是由镰刀菌霉产生的具有强毒性的真菌代谢物。Tüdos等[40]成功的应用Biacore Q检测了缓冲液和小麦中的deoxynivalenol，将deoxynivalenol与酪蛋白偶合之后被固定在经过氨基偶联的羧甲基葡聚糖修饰的芯片表面，deoxynivalenol与其过量的抗体混合并培育一段时间后，流经传感器表面进行检测，在缓冲液中的检测限为2.5ng/mL，其检测结果与液-质联机检测的结果一致。

3 展 望

SPR生物传感器经过20多年的发展，已成为生化分析中备受瞩目的研究分析工具。近几年，随着分子生物学和分子免疫学的不断突破和仪器自身结构的不断改进，SPR生物传感器在食品微生物的应用前景将更为广阔。各种单克隆抗体的不断问世，为SPR生物传感器敏感膜的多样性提供了可能。通过利用固定有不同单克隆抗体的SPR生物传感器，食品中各种微生物的鉴定及其含量的测定等都将成为现实。

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Application of SPR Biosensor in the Detection of Food Microorganisms：A Review

LIU Xia，LI Zong-jun*
(Key Laboratory of Food Science and Biotechnology of Hunan Province, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Surface plasma resonance (SPR) is one of modern analytical techniques and can be used for monitoring inter-molecular interaction in real time. In addition, it can also be applied to detect biochemical parameters in an accurate, fast and convenient manner. Moreover, the detection of food microorganisms using SPR has been attracted extensive attentions in recent years. Current progresses in the detection of food microorganisms through SPR technique has been reviewed in this paper.

surface plasma resonance；biosensor；food microorganism；detection

Q93-332

A

1002-6630(2010)09-0301-05

2009-07-30

国家“863”计划重点项目(2008AA10081)；湖南农业大学引进人才基金项目(08YJ07)

刘霞(1976—)，女，副教授，博士，研究方向为食品分析、食品生物技术。E-mail：liuxia608@gmail.com

*通信作者：李宗军(1968—)，男，教授，博士，研究方向为食品微生物学。E-mail：lizongjun@yahoo.com.cn