拮抗微生物诱导采后果蔬抗病性的机制

罗 杨，明 建,2，曾凯芳,2,*

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715)

拮抗微生物诱导采后果蔬抗病性的机制

罗 杨1，明 建1,2，曾凯芳1,2,*

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715)

综述拮抗微生物诱导采后果蔬抗病性的机制。拮抗微生物能够诱导果蔬产生植物保卫素，提高果蔬防御酶如几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶和多酚氧化酶的活性，并能够通过调节活性氧代谢和提高果蔬结构抗性，从而增强果蔬的抗病性。拮抗微生物诱导采后果蔬抗病性的机制研究将为生物防治技术在采后果蔬病害防治中的应用提供参考依据。

生物防治； 拮抗微生物； 采后病害； 诱导抗病性机制

化学杀菌剂对环境和农产品的污染直接影响人类的健康，已成为当今公众所关注的主要问题之一。为了保证农产品的卫生和安全，世界各国都在探索能代替化学农药的防腐保鲜新技术。采后生物防治作为21世纪七八十年代迅速发展起来的控制采后果蔬病害的新技术，在国内外已得到了广泛的研究[1-2]，并且在欧美一些发达国家得到商业化运用[3]。拮抗微生物不仅能作为生物防治剂直接与病原菌作用控制真菌病害的发生，更能作为自然抗病性的激发子，诱导果蔬自身的系统抗性，提高果蔬免疫力，延长果蔬保鲜期。因此，利用拮抗微生物诱导采后果蔬抗病性为果蔬产品采后病害防治开辟了一条安全环保的途径。

目前很多研究都致力于拮抗微生物诱导植物抗病机制的研究，但对于采后果蔬生物防治机制的研究相对滞后，目前有关拮抗微生物诱导采后果蔬抗病性机制的研究主要从以下几方面进行探讨。

1 诱导产生植物保卫素

植物保卫素(phyto alexin，PA)是植物在被各种微生物、化学物质或机械伤害刺激下合成积累的一类具有抗菌活性的低分子质量脂溶性化合物，主要是异黄酮类和萜类物质，随着采后果蔬的成熟或贮藏期的延长，PA积累能力逐步下降，感病性也逐步增加。很多拮抗微生物可以诱导果实产生PA。Arras等[4-5]将无名假丝酵母(Candida famata)作用于柑橘果实后发现这种拮抗菌可以诱导柑橘产生植保素和7-羟基-6-甲氧基香豆素(scopoletin)等抗性物质；将季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)接种柑橘果实后，柑橘伤口组织合成PA

蒿属香豆素(scoparone)和东莨菪苷原(scopoletin)。Droby等[6]在研究假丝酵母(Candida oleophila)对葡萄采后青霉菌的拮抗作用时发现，向葡萄果皮组织上添加假丝酵母细胞悬浮液可诱导PA的积累。果实中积累的PA常常是通过结合果实在受到侵染或激发后产生的结构变化(如乳突、木质层等)对病原菌的生长和扩散进行抑制。

2 诱导产生防御酶

果蔬在受到病原生物或各种逆境因子作用后，诱导产生一类可直接或间接抑制病原微生物生长、提高果蔬自然抗病能力的蛋白质，称为防御酶。它们的防御机制主要是指直接抑制或杀死病原菌、参与抗性物质合成以及调节果蔬体内活性氧代谢等方面。这类酶的基因表达量在果蔬正常生长过程中很低，但在果蔬遭受病原生物或逆境因子诱导后可大量表达[7]。

2.1 胞外水解酶

几丁质酶(chintinase)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-g l uc a n a se)是广泛存在于果蔬体内的病程相关蛋白(pathogenesis related proteins，PRP/PRs)的典型代表。由于病原真菌的细胞壁主要成分为几丁质和β-1,3-葡聚糖，这两种胞外水解酶可通过降解真菌细胞壁组分，使原生质膜破裂而直接杀死病原菌，达到保护寄主的作用[8]。二者在降解真菌细胞壁反应中呈现协同作用，并且二者活性会随着果蔬贮藏时间的变化而变化，从而影响果蔬的抗病能力[9]。研究表明，拮抗微生物可提高果蔬体内这两种胞外水解酶的活性。Ippolito等[10]发现出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)应用于苹果上可以显著诱导提高苹果果实的几丁酶、β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶的活性。D r o b y等[6]将假丝酵母(C a n d i d a oleophila)作用于采后葡萄时也发现，葡萄果实中的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性有明显增高。田世平等[11]的研究表明季也蒙假丝酵母(Candida guiliermondii)和膜醭毕赤酵母(Pichia membranefacien)可以诱导桃果实产生较高水平的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性，增强对桃子软腐病的抑制效果；阿比达斯隐球酵母(Cryptococcus albidus)也可诱导提高果实几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性，尤其是几丁质酶的活性，明显高于对照和膜醭毕赤酵母处理组[12]。

2.2 抗性物质合成酶

果蔬体内的抗性物质主要是木质素、酚类物质以及P A之类，果蔬体内许多防御酶如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine am monia-lyase，PAL)、过氧化物酶(peroxidase，POD)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)等都有参与或催化抗性物质合成的作用。PAL作为果蔬丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶，被认为是与果蔬抗病反应密切相关的酶类，它通过专一催化由莽草酸途径产生的L-苯丙氨酸，经历苯丙烷代谢途径，产生一系列如黄酮体、木质素、生物碱等与果蔬抗性相关的苯丙烷类化合物。Wisniewski等[13]在研究拮抗酵母菌P.guilliermondii诱导苹果、桃、柑桔抗病性时发现果实经拮抗菌处理后其PAL活性明显提高。

POD和PPO也是果蔬体内十分重要的抗性物质催化合成酶，它们在果蔬体内不仅参与乳突中酚类物质的聚合和氧化反应，还促进木质素和PA的合成[14]。研究表明果蔬产品的这些与抗性相关物质合成有关的防御酶类活性可由拮抗菌诱导提高。接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitle)能明显减轻苹果果实炭疽病的发生，诱导苹果果实中POD和PPO活性的升高[15]。采后桃果实上接种拮抗酵母菌P.Membranefaciens后PPO、 POD、PAL活性都有所升高[16]。王博等[17]在研究柠檬形克勒克酵母对温州蜜柑“国庆一号”采后贮藏的防腐效果时也发现拮抗酵母菌悬液对蜜柑的过氧化物酶(POD)活性有诱导提高的作用。罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)作用于梨果实也能显著增高果实的POD活性，延长梨果实的贮藏期[18]。

3 调节活性氧代谢

果蔬受到病原菌侵染或逆境因子等生物或非生物因素胁迫时，细胞内会急剧产生大量的活性氧，这时必须依靠体内活性氧清除系统使活性氧含量始终处于动态平衡的状态。拮抗微生物可通过诱导提高果蔬体内活性氧代谢相关酶类的活性进而调节果蔬的抗病反应。其中，POD、超氧化物歧化酶(superoxide d ismutase，SOD)以及过氧化氢酶(catalase，CAT)在清除活性氧、阻止活性氧的形成等方面起着重要作用[19]。当这些活性氧相关酶的活性受到来自果蔬自身内源激发子或外来非生物或生物激发子(包括拮抗菌)的诱导而提高时，果蔬的抗病能力也随之提高。有研究表明，经拮抗菌发酵液处理的柑橘果实的霉变率明显低于对照组，进一步测定结果表明，经拮抗细菌和酵母菌处理后柑橘果实的POD及SOD的活性在各测定时间段都比对照组高[20]。研究膜醭毕赤酵母(Pichia membranefacien)对采后番茄果实病害的防治效果时也发现果实的SOD、CAT活性在经拮抗菌处理后有明显升高，同时拮抗菌悬液处理组果实的发病率与病斑直径均小于对照果实[21]。

4 诱导产生结构抗性

采后果蔬在受到外来拮抗微生物激发子的诱导后会发生细胞组织结构的变化，形成一些可以阻止病原菌入侵的特殊结构来保护自身。Wilson等[22]在观察苹果伤口处酵母菌C.saitoana和B.cinerea作用的超微结构时发

现，酵母细胞不仅能防止病原菌菌丝对寄主细胞的降解，还能使病菌菌丝肿胀变形，并诱导寄主细胞产生乳突状结构，封填细胞内部空间以阻止真菌入侵。另外，拮抗菌还可通过改变伤口周围的化学或渗透压环境，使之适合拮抗生物生长而不利病原菌生长，从而提高寄主的抗病性。

5 与其他物质的协同作用

拮抗微生物单独作为果蔬产品采后生物保鲜剂使用时的控病能力相对于传统的化学杀菌剂来讲较低，诱导能力也比较有限，这也是限制商业生物保鲜剂开发与应用的关键因素[23]。提高拮抗微生物诱导果蔬采后抗病性的能力主要可通过复合添加一些特定的抗病诱导因子来实现，这些物质主要有：水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及其酯类、还有某些金属盐类以及一些生长调节剂如赤霉素等。Cao等[24]在研究拮抗酵母对枇杷炭疽病的防治效果时发现用茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)与膜醭毕赤酵母(Pichia membranefaciens)复合处理时，几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性比单独用拮抗酵母或茉莉酸甲酯处理要高，能够更好地抑制炭疽病的发生。俞庭等[25]在研究罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)与水杨酸(salicylic acid，SA)复合对梨果实青霉及灰霉病的防治效果时发现复合处理也比单独使用拮抗酵母或水杨酸效果好。另外的研究也表明将丝孢酵母菌(Trichosporon spp.)、黏红酵母菌(Rhodotorula glutinis)、毕赤酵母菌(Pichia spp.)与Ca2+配合使用时对苹果灰霉病、青霉病、柑橘绿霉病以及桃根霉腐烂病的抑制效果明显增强，还可抑制Rhizopus stolonifer菌孢子的萌发和菌丝的生长[2,26]。罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)与赤霉素(gibberellic acid，GA3)复合处理梨果实在控制梨青霉病的效果上优于单独使用赤霉素[18]。除了通过在拮抗菌悬浮液中添加各种生物或化学抗病诱导物质外，也可将拮抗菌与物理诱导方法相结合以提高拮抗菌制剂的诱导抗病性能力。如将经过拮抗菌假单胞菌(Pseudomonas glathei)处理的柑橘果实在24h后以30℃进行热处理能显著增强果实对绿霉病的抗病能力[27]。

6 结 语

利用拮抗微生物诱导采后果蔬抗病性，达到抑制病害发生、减少病害危害的目的，满足人们追求健康、保护环境的需求，适应社会发展的方向。但目前国内外只有Biosave拮抗菌株为洋葱假单胞菌(Pseudomonas syringae Van Hall)和拮抗菌株美极美奇酵母(Metschnikowia fructicola)，这两种拮抗菌商业生物保鲜剂真正应用于实际生产，且市场占有率都极低[28]。而近年来应用于美国和以色列的生物保鲜剂AspireTM(拮抗菌株为假丝酵母，Candida oleop hila)已经由于其商业不适用性而退出市场。诱抗高效性和持久性方面的欠缺是拮抗菌生物保鲜制剂在商业应用方面屡屡受阻的主要原因[29]。由于果蔬产品的逐渐衰老和采摘后的能量短缺会大大降低产品的抗性反应，这使得果蔬产品的采后诱导抗性难以逾越采前的水平。此外，将拮抗菌保鲜制剂运用于生产实践的困难还来源于实验室研究与商业化应用之间缺乏联系，实验室研究往往只考虑到拮抗菌对已知病害特别是外部侵染病害的控制能力，而忽略了果蔬内部的潜在性感染，更加无法预测果蔬在贮藏、运输、销售过程中可能遭受的各种复杂的不稳定环境因素，这也在一定程度上加剧了拮抗菌实际应用的难度。要提高拮抗菌在采后贮藏环境中控制病害的效率应该在继续优选性状优良的拮抗菌的基础上，将采前与采后诱导防治工作结合起来，更多的考虑复合其他物理化学处理措施来提高拮抗微生物诱抗防病的能力，并且要从分子生物学的水平对诱导抗性及其他拮抗机制，尤其是植物诱导抗病的信号转导和分子机制等问题进行深入研究。

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Disease-resistant Mechanism of Post-harvest Fruits and Vegetables Induced by Antagonists

LUO Yang1，MING Jian1,2，ZENG Kai-fang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

Disease-resistant mechanism of post-harvest fruits and vegetables induced by antagonists has been reviewed. The antagonists improved resistance to disease in fruits and vegetables by improving the content of phyto alexi and the activities of defense enzymes such as chintinase (CHI), β-1,3-glucanase, phenylalanine ammonia-lyase (PAL), peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO). The antagonists also regulated the active oxygen metabolism, and strengthened the resistance of organization structure in fruits and vegetables. These studies on disease-resistant mechanism induced by the antagonists will provide

for the application of biological technology for disease control in post-harvest fruits and vegetables.

biological control；antagonist；post-harvest disease；induced disease-resistant mechanism

S609.3；S667.7

A

1002-6630(2010)09-0297-04

2009-07-18

国家自然科学基金项目(30700556)；“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD22B03)；西南大学研究生科技创新基金项目(ky2009010)

罗杨(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品贮藏工程。E-mail：594luoyang@163.com

*通信作者：曾凯芳(1972—)，女，副教授，博士，研究方向为食品贮藏工程。E-mail：zengkaifang@163.com