EOLA1基因在 DA大鼠移植肝脏急性排斥反应中表达的初步研究*

冉崇福,窦科峰,刘少山,郑仲谨,梁自文,刘永康

(1.解放军第四五二医院肝胆科,四川 成都 610021;2.第四军医大学西京医院肝胆科,陕西 西安 710032;3.第三军医大学西南医院,重庆 400038)

近年梁自文等[1-3]在研究烧伤、创伤后炎症反应状态时,发现一种人内皮细胞活化新基因 EOLA1,并显示出 EOLA1参与了炎症反应过程,在富血管组织有高表达。我们前期研究发现,EOLA1在人类肝脏组织也有较高表达,参与了血管的修复和炎症时细胞的自我保护反应[3]。肝脏移植急性排斥反应最常见的是表现为免疫排异引起的肝内严重炎症反应,新基因 EOLA1是否参与了急性免疫排斥所引起的肝内严重炎症反应过程、起着什么样的作用还不清楚,为此,本实验通过建立近交系大鼠同种异体原位肝移植急性排斥反应模型(DA→Lewis),对新基因 EOLA1在 DA大鼠移植肝脏急性排斥反应时的表达情况做了初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组:雄性近交系 DA大鼠 30只和 Lewis大鼠 90只,体重 200-220g,分别购自哈尔滨医科大学动物中心、北京维通利华实验动物有限公司。本研究分为 A、B两组,A组 30例:Lewis→Lewis大鼠肝脏移植作为移植耐受组做对照;B组30例:DA→Lewis大鼠肝脏移植急性排斥反应模型。

1.2 实验药品及器材:凝胶回收试剂盒,Promega公司;PCR回收试剂盒,Roche公司;RT-PCR试剂盒,TaKaRa公司;全自动生化分析仪(Becman公司,CX-7);Du-640紫外分光光度计,美国 Beckman;PCR仪 ,美国 M.J.。

1.3 实验方法

1.3.1 移植模型建立:大鼠肝脏移植模型的建立按照改良“二袖套”法完成[4]。A组:移植耐受组(n=30),选用 Lewis大鼠 60只,30只为供体,30只为受体,建立 30例肝脏移植耐受模型;B组:急性排斥组(n=30),选用 DA大鼠 30只为供体,Lewis大鼠 30只为受体,建立 30例肝脏移植急性排斥模型。

1.3.2 检测指标及方法:①大鼠原位肝移植术后的生存时限,每组 5只观察移植术后平均存活天数。②肝功能检查 分别于术后 1、3、5、7、10天处死大鼠,经腹主动脉抽血2 ml离心后取上层血清测ALT、TBIL。 ③病理学检查 分别于术后 1、3、5、7、10天处死大鼠,取部分新鲜肝组织,福尔马林固定 24小时,常规石蜡包埋、切片、苏木素 -伊红(HE)染色后镜检。④移植肝组织 EOLA1基因的表达 Western blot检测移植肝组织 EOLA1的表达,每组于术后 1、3、5、7、10天处死大鼠,取部分新鲜肝组织液氮保存。提取总蛋白,以变性总蛋白进行 Western blot检测,每次电泳均包含各组,一抗为前期制备的抗EOLA1多抗[5],二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG工作液,检测术后 1、3、5、7、10天 5个时间点的 EOLA1水平。用 ECL系统软件半定量分析,计算各组平均值。

1.4 统计学处理:所有数据分析均通过 SPSS 10.0进行。计量数据以 (x-±s)表示,组内与组间样本均数两两比较采用 t检验,p＜0.05为差异显著,p＜0.01为差异非常显著。

2 结 果

2.1 大鼠肝移植术后一般情况的观察:大鼠肝移植60例次,平均手术时间 90分钟,无肝期(14.0±2.5)秒。手术死亡 1例,术后肝上下腔静脉出血 1例,门静脉出血 1例。A组平均生存时间超过 100天,B组平均存活时间(16.2±1.4)天;两组比较相差非常显著(p＜0.01)。

2.2 肝功能检查:A组大鼠肝移植术后第 1天ALT、TBIL有轻度增高,至第 3天降至正常。B组第1天开始 ALT、TBIL逐渐升高,第 10天达到高峰,两组比较相差非常显著(p＜0.01)。

2.3 移植肝组织 EOLA 1的表达:术后 1、3、5、7、10天 5个时间点的 EOLA1水平,A组移植肝组织 EOLA1表达高,B组较低(见图 1);A、B两组术后 5个时间点 EOLA1表达的灰度值比较,相差非常显著(见图2 p＜0.01)。

2.4 病理学检查:A组未见明显的病理损害;B组术后第 5天开始出现汇管区炎细胞浸润,第 10天明显加重,可见汇管区及中央静脉周围大量的单核淋巴细胞浸润,肝细胞坏死,出现静脉内皮炎和胆管上皮炎,胆管上皮细胞可出现变性、坏死及脱落,甚至可见炎性浸润扩展至肝实质。

3 讨 论

近交系大鼠 DA→LEW是国际上比较公认的肝移植急性排斥动物模型,具有研究周期短、模型稳定、病理改变典型、可重复性好的优点,因此本实验在 Kamada建立的“双袖套”法的基础上,改良建立实验模型[4]。实验结果表明:耐受组移植术后血清ALT和TBIL以及移植肝脏组织病理基本正常,无明显的排斥反应;排斥反应组术后第 5天血清 ALT和TBIL开始出现升高、第 10天达到高峰,移植肝脏组织病理第 5天出现汇管区炎症细胞浸润、且随着时间而加重,第 10天汇管区更加严重出现明显的血管内皮炎和胆管上皮炎、炎细胞侵犯到肝实质、肝细胞片状坏死,参照人排斥反应的 Banff标准,符合急性排斥反应诊断标准,能满足本实验的要求[4,6]。

本实验大鼠肝移植术后 EOLA 1的表达耐受组与急性排斥组相差非常显著,从术后 5个时间点的变化趋势分析,急性排斥组大鼠移植肝脏组织随着时间的延长,免疫排斥反应越严重、移植肝脏组织炎性反应和组织坏死越明显,但 EOLA1的表达水平相比耐受组低下,EOLA1表达水平的高低与移植肝组织内急性排斥反应的严重程度存在一定程度的负相关,即排斥反应越重 EOLA1的表达越低。

EOLA 1是人内皮活化相关新基因,前期研究发现 EOLA1与细胞内抗金属硫蛋白 2A(metallothio-nein 2A,MT2A)发生相互作用,而 MT2A广泛分布于各组织细胞,具有多种重要的生理功能,主要参与金属代谢、对抗内毒素脂多糖(LPS)、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等。EOLA 1与 MT2A相互作用参与了对细胞生长的影响,因为当在细胞内稳定高表达 EOLA1后,细胞增殖明显加强,但是,在炎症刺激时,内皮细胞表达 EOLA1增高,与胞内蛋白 MT2A发生相互作用,这种作用信号进一步转导到核内,调控相关基因的表达,促进了细胞的生长,有助于血管的修复和炎症时细胞的自我保护反应[1,2,3,7]。

新基因 EOLA1在体内系统性炎症反应中具有保护调节作用[7],结合本实验结果,我们推测 EOLA1在肝脏组织中也可能发挥了抗排斥和保护肝内血管内皮细胞以及移植肝细胞的作用。

[1] Ziwen L,ZongchengY.Identification and characterization a novel gene EOLA1 stimulating ECV304 cell proliferation[J].Biochem Biophysic Res Comun,2004,325(22):798-802

[2] 梁自文,杨宗城,罗向东,等.人内皮细胞活化相关新基因 EOLA 1的发现及初步研究[J].解放军医学杂志,2003,28(5):422-424

[3] 梁自文,杨宗城,罗向东,等.内皮细胞活化相关新基因 EOLA 1的亚细胞定位及组织表达[J].解放军医学杂志,2004,29(4):342-344

[4] 冉崇福,窦科峰,刘永康,等.DA→LEW大鼠肝脏急性排斥反应模型的技术改进与评价[J].西南国防医药,2007,17(3):278-280

[5] 梁自文,王清良,杨宗城,等.EOLA 1抗体的制备及肿瘤组织中EOLA 1的表达检测[J].第三军医大学学报,2009,31(24):2418-2420

[6] 浦立勇,姚爱华,李相成,等.DA到 Lewis大鼠肝脏移植急性排斥模型的建立[J].第四军医大学学报,2006,27(12):1071-1073

[7] 梁自文,杨宗城,刘明月,等.刺激 ECV 304细胞增殖的新基因EOLA 1的克隆与功能研究[J].中华医学遗传学杂志,2005,22(5):518-523