用安德森空气生物采样器采集病毒气溶胶的研究

陈岚，车红，任丽丽，王健伟

·论著·

用安德森空气生物采样器采集病毒气溶胶的研究

陈岚*，车红*，任丽丽，王健伟

【摘要】

目的以表达绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的重组腺病毒（rAdvGFP）为模式病毒，进行气溶胶的主动发生实验和模拟剧烈吹打、振荡混匀等操作，利用安德森采样器进行气溶胶的采集，以建立简单易行的病毒气溶胶采集检测体系。

方法用气溶胶发生器模拟模式病毒的气溶胶主动发生，分别在距离发生器管口 0、10 和 20 cm 处放置采样器及培养皿，在气溶胶发生 30 s 时开始采集，共采集 5 min。在模拟吹打操作中，将 10 ml 病毒液置于 50 ml 离心管中，用微量移液器反复吸取吹打病毒液；在模拟振荡操作中，将10 ml 病毒液置于 50 ml 离心管中盖紧，以振荡器最大速度涡旋振荡 1 min，立即打开管盖采集 2 min，然后盖紧再重复振荡 30 s 后开盖继续采集。两种模拟操作均在距离管口 0 和 10 cm 处放置采样器及培养皿，各采集 5 min。收集各采样器及培养皿中的液体，利用阳离子聚合物聚凝胺浓缩后用 PCR 方法检测病毒核酸，并接种人胚肾 293 细胞进行病毒的培养，在荧光显微镜下观察 GFP 蛋白的表达。

结果模拟气溶胶主动发生时，将置于距发生器管口 0、10和 20 cm 的采样器和培养皿中的采集液接种细胞均可观察到绿色荧光，并可检测到病毒核酸。模拟剧烈吹打时，置于0 cm 处的培养皿内可检测到病毒，而置于 0 cm、10 cm 处采样器和 10 cm 处培养皿中均未检测到病毒。在剧烈振荡模拟试验中，在距离管口 0 cm 的采样器和培养皿中均可检测到病毒，在置于 10 cm 处的采样器中未检测到病毒，在置于 10 cm 处的培养皿中可检测到病毒。

结论利用 rAdvGFP 模式病毒和安德森采样器初步建立了病毒学实验气溶胶收集检测体系，对模拟危险操作感染性材料所产生的气溶胶做出危险评估，为制定病毒学实验操作规范提供了依据。

【关键词】空气微生物学； 病毒学； 安全管理； 危险性评估； 生物气溶胶

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2010, 5(5):342-347

气溶胶是由悬浮于气体介质中的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系，其粒径一般为 0.001 ～ 100 μm[1]。悬浮于大气中的含有微生物或生物大分子等生命活性物质的固态或液态微粒称为生物气溶胶包括病毒、细菌、真菌、多肽、花粉等微生物[2]。生物气溶胶对人类的生命健康会造成极大影响，世界上 41 种主要传染病中有 14 种可通过空气气溶胶传播，20% 呼吸道感染是由气溶胶引起，其中以病毒占首位[3]。实验室在进行感染性材料操作时，在多个环节均可产生气溶胶，尤其是常见的吹打、移液和涡旋振荡等操作更容易产生气溶胶，从而威胁操作人员的安全。对这些危险操作产生气溶胶的实验评价不仅有助于规范生物安全实验室工作人员的操作，避免职业感染，同时也为生物安全管理提供切实的实验数据。而如何有效收集操作中可能产生的气溶胶，是进行危险因素实验分析的关键。

目前，关于细菌等空气微生物气溶胶采集及采样器采样效率的比较研究报道较多[4-6]。但是由于病毒气溶胶浓度低、采集难，病毒的感染力及活性易降低，且传统检测方法灵敏度低，其研究受到限制[3]。为建立简单快速的病毒气溶胶采集方法，本研究以表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒（rAdvGFP）为模式病毒，采用了分级采集不同粒度气溶胶的二级安德森采样器，并通过病毒浓缩及快速离心法培养鉴定病毒和利用 PCR 检测病毒核酸等技术建立了病毒气溶胶的采集检测方法，利用该方法对人工主动发生以及剧烈吹打、振荡等模拟实验操作中产生的气溶胶进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与病毒株 人胚肾 293 细胞购自美国 Invitrogen 公司；表达绿色荧光蛋白（GFP）的复制缺陷型 5 型重组腺病毒 rAdvGFP 为本室构建。

1.1.2 试剂与仪器 细胞培养基 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（Dulbecco modified Eagle medium，DMEM）、血清、碳酸氢钠和青链霉素购自美国 Invitrogen 公司；dNTP 和 Taq 酶购自日本 TaKaRa 公司；Hank 液购自美国 Hyclone 公司。PTC-200PCR 仪为美国 Bio-Rad 公司产品；miniMAG 自动核酸提取仪为法国生物梅里埃公司产品；NU-4750E 细胞培养箱、NU-425-400E IIA2型生物安全柜为美国 Nuaire 公司产品；ECLIPSE 80i 荧光显微镜为日本 Nikon 公司产品；二级安德森微生物气溶胶采样器由辽阳市应用技术研究所提供；DV40 型全玻璃直角气溶胶发生器由北京比赛福生物安全技术有限公司提供。

1.2 方法

图 1 rAdvGFP 病毒气溶胶主动发生后各采样器中病毒培养检测结果[A：气溶胶发生器及采样器和培养皿放置位置及编号示意图；B：采样器和培养皿中的病毒检测结果（1：阳性对照；2 ～ 7：距离发生器 0 cm，10 cm，20 cm 组的采样器 1，2检测结果；8 ～ 10：分别为距离发生器 0 cm，10 cm，20 cm 组的培养皿 3 中采集液病毒培养结果；11：阴性对照）；C：PCR 检测结果（M：DNA 分子量标准；1：阳性对照；2 ～ 7：分别为距离发生器 0 cm，10 cm，20 cm 组的采样器 1，2 的PCR 结果；8 ～ 10：为距离发生器 0 cm，10 cm，20 cm 组的培养皿 3 的 PCR 结果；11：阴性对照）]Figure 1 Results of rAdvGFP expression collected from the dishes and aerosol sampler after the initiative aerosol generation. A: The schematic of positions of aerosol generator, sampler and dishes; B: Fluorescence analysis of rAdvGFP collected from the dishes and aerosol sampler (1: Positive control; 2 - 7: 0 cm, 10 cm, 20 cm groups, aerosol sampler 1, 2, respectively; 8 - 10: 0 cm,10 cm and 20 cm groups, dish 3, respectively; 11: Negative control); C: The detection results of PCR (M: DNA Markers; 1: Positive control; 2 -7: 0 cm, 10 cm and 20 cm groups, aerosol sampler 1 and 2, respectively; 8 - 10: 0 cm,10 cm and 20 cm groups, dish 3, respectively; 11: Negative control).

1.2.1 气溶胶主动发生的模拟 在生物安全柜正常运转情况下，在柜内将 10 ml rAdvGFP 病毒液置于 DV40全玻璃直角气溶胶发生器内。发生器和安德森采样器的摆放位置如图 1A，发生器管口距离安全柜台面约 12 cm。分别在距离发生器管口 0、10 和 20 cm 处的安全柜台面上放置采样器和培养皿，用于病毒气溶胶和沉降病毒颗粒的采集。采样器分上下两层，其采样撞击孔孔径分别为 0.5 和0.2 μm，内置培养皿，在每组采样器的内侧平行位置放置 3 个培养皿，每个培养皿内放置 5 ml 采集液，在气溶胶发生 30 s 后，计时连续采集 5 min，收集各采样器及培养皿中的液体进行检测。

1.2.2 吹打及振荡模拟试验 将 10 ml 病毒液置于 50 ml 离心管中，离心管距离安全柜操作台面约12 cm。在模拟吹打的操作中，用微量移液器反复吸取吹打病毒液，期间避免病毒液溢洒和喷溅；在模拟振荡操作中，将 10 ml 病毒液置于 50 ml 离心管中，用振荡器的最大速度涡旋振荡病毒液1 min 后立即打开管盖采集 2 min，然后盖紧再次震荡 30 s 后开盖继续采集，模拟振荡的操作见图 2A。两组模拟操作中，均在距离离心管管口0 和 10 cm 处的安全柜台面上放置采样器，在采样器的内侧平行位置放置培养皿进行病毒的采集，均采集 5 min 后收集各采样器及培养皿中的采集液进行检测。

1.2.3 病毒浓缩 将采样器和培养皿中的采集液收集到 15 ml 离心管中，加入终浓度为 400 μg/μl的阳离子多聚物聚凝胺（polybrene，PB），置 37 ℃孵育 30 min，于室温 2300 × g 离心 40 min 后弃上清，悬于 800 μl 不含血清的 DMEM 孵育液，得到浓缩后样本。取浓缩后的样本 200 μl 接种至24 孔板上培养单层的人胚肾 293 细胞（8 × 104细胞/孔），每个样本接种 2 孔，700 × g 室温低速离心 45 min，在 37 ℃、5% CO2培养箱中孵育 1 h后弃去孵育液，更换含 2% 胎牛血清的 DMEM培养液继续培养 48 h 后，在荧光显微镜下观察GFP 荧光。对未见明显 GFP 荧光出现的样本连续培养 3 代，培养 3 代后仍未见 GFP 荧光的则认为病毒未复制。所有试验均重复 3 次。

图 2 模拟剧烈振摇病毒液后采样器中病毒培养检测结果[A：模拟病毒液剧烈震荡图示；B：模拟涡旋振荡病毒液后采样器和平皿中的病毒检测结果；B（1：阳性对照；2 ～ 4：分别为距离管口 0 cm 组的采样器 1，2 和培养皿 3 中采集液病毒培养结果；5 ～ 7：分别为距离管口 10 cm 组的采样器 1，2 和培养皿 3 中采集液病毒培养结果； 8：阴性对照）；C：浓缩后 PCR 检测结果（M：DNA分子量标准；1：阳性对照； 2 ～ 4：分别为距离管口 0 cm 组的采样器 1，2和培养皿 3 中采集液PCR结果；5 ～ 7：分别为距离管口 10 cm 组的采样器 1，2 和培养皿 3 中采集液 PCR 结果；8 阴性对照）]Figure 2 Results of rAdvGFP collected from the dishes and aerosol sampler after the vortexing of viruses. A: The mimic of vortexing; B: Fluorescence analysis of rAdvGFP collected from the dishes and aerosol sampler (1: Positive control; 2 - 4: 0 cm group, aerosol sampler 1, 2 and dish 3, respectively; 5 - 7: 10 cm group, aerosol sampler 1, 2 and dish 3, respectively; 8: Negative control); C: The detection results of PCR (M: DNA Markers; 1: Positive control; 2 - 4: 0 cm group, aerosol sampler 1, 2 and dish 3, respectively; 5 - 7: 10 cm group, aerosol sampler 1, 2 and dish 3, respectively; 8: Negative control).

1.2.4 PCR 检测 取 200 μl 浓缩样本用miniMAG 自动核酸提取仪提取病毒核酸，用腺病毒特异性引物进行 PCR 检测。腺病毒检测引物序列分别是上游 AdVF：5’ GCCSCARTGGKCWTAC ATGCACATC 3’；下游 AdVR：5’ CAGCACSCCICG RATGTCAAA 3’[7]。PCR 反应体系，10 × 缓冲液2 μl、10 mmol/L 的 dNTP 0.4 μl、50 μmol/L 上、下游引物各 0.3 μl、5 U/μl 的 Taq DNA 聚合酶0.2 μl、灭菌双蒸水 14.8 μl、核酸 2 μl，总体积为20 μl。PCR 反应程序为：94 ℃ 预变性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。反应结束后取 5 μl 扩增产物进行2% 琼脂糖凝胶电泳分析，扩增目的片段大小为301 bp。

2 结果

2.1 主动发生后气溶胶的采集

为了评价安德森采样器的采样效率以建立方便的病毒气溶胶采集体系，首先用气溶胶发生器模拟病毒气溶胶的主动发生，将采样器和采集沉降病毒的平行放置培养皿中的采集液经 PB 浓缩后，进行核酸检测和接种 293 细胞，观察病毒的复制。在距离发生器管口 0 和 10 cm 处放置的各培养皿和采样器以及在距发生器管口 20 cm 处放置的培养皿和采样器 2 中均检测到病毒核酸，但置于20 cm 处的采样器 1 未检测到病毒核酸。用上述样本接种 293 细胞，在培养 48 h 后均可在荧光显微镜下观察到细胞中的绿色荧光。这些结果表明，在距离发生器管口 0、10 和 20 cm 处放置的不同孔径的采样器中均可采集到病毒气溶胶（图 1B、1C）。

2.2 剧烈吹打和振荡模拟试验的气溶胶采集

图 3 模拟吹打病毒液后各采样器中病毒培养检测结果[A：采样器和培养皿中的病毒检测结果（1：阳性对照；2 ～ 4：分别为距离管口 0 cm 组的培养皿 3 和采样器 1，2 中采集液病毒培养结果；5 ～ 7：分别为距离管口 10 cm 组的培养皿 3 和采样器 1，2中采集液病毒培养结果；8：阴性对照）；B：浓缩后 PCR 检测结果（M：DNA 标准分子量；1：阳性对照；2 ～ 4：分别为距离管口 0 cm 组的培养皿 3 和采样器 1，2 中采集液 PCR 结果；5 ～7：分别为距离管口 10 cm 组的培养皿 3 和采样器 1，2 中采集液 PCR结果；8：阴性对照）]Figure 3 Results of rAdvGFP collected from the dishes and aerosol sampler after the pipetting of viruses. A: Fluorescence analysis of rAdvGFP collected from the dishes and aerosol sampler (1: Positive control; 2 - 4: 0 cm group, dish 3 and aerosol sampler 1, 2, respectively; 5 - 7: 10 cm group, dish 3 and aerosol sampler 1, 2, respectively; 8: Negative control); B: The detection results of PCR (M: DNA Markers; 1: Positive control; 2 - 4: 0 cm group, dish 3 and aerosol sampler 1, 2, respectively; 5 - 7: 10 cm group, dish 3 and aerosol sampler 1, 2, respectively; 8: Negative control).

用主动发生的气溶胶确定了安德森采样器对病毒气溶胶的采集能力后，进一步模拟了剧烈吹打和振荡两种实验操作，分析气溶胶的产生情况。将采样器和平行放置的培养皿中的采集液浓缩后，进行病毒核酸检测并接种 293 细胞培养后通过观察绿色荧光对病毒进行检测。PCR 检测结果显示，在距离发生器管口 0 cm 处平行放置的培养皿中可检测到病毒核酸，而在距管口 0 和 10 cm 处放置的采样器和距管口 10 cm 处放置的培养皿中均未检测到病毒核酸。荧光显微镜观察结果显示，在模拟吹打的操作中，在距发生器管口 0 cm 处平行放置的培养皿内采集的样本中检测到病毒，而在距管口 0 和 10 cm 处放置的采样器和距 10 cm 处放置的培养皿内采集的样本中均未检测到病毒（图3A、3B）；在模拟振荡操作中，在距离发生器管口0 cm 处的气溶胶采样器和平行放置的培养皿中均能检测到病毒，置于距管口 10 cm 处的上层气溶胶采样器和平行放置的培养皿中均检测到病毒。在距离管口 10 cm 的下层气溶胶采样器中的荧光观察和 PCR 检测两种方法均未检测到病毒（图 2B、2C）。

3 讨论

目前，关于开展空气微生物气溶胶采样研究较多，根据不同原理制造的采样器广泛用于各领域。如：单级或多级撞击式采样器，离心式采样器，气旋式采样器，液体冲击式采样器，过滤式采样器等[8]。在这些类型采样器中，以安德森空气微生物采样器采样效率最高，所采粒子数较多[4]。在分级采集不同粒度气溶胶的时候，经常采用安德森采样器。在实验中也尝试使用全玻璃液体冲击式（AGI）采样器进行病毒气溶胶的采集，但是没有检测到模式病毒。而用安德森采样器可在距离气溶胶发生器0 ～ 20 cm 内采集到主动发生的病毒气溶胶，表明安德森采样器适用于 rAdvGFP 模式病毒气溶胶采集。表达 GFP 的重组腺病毒已经用于评价病毒学实验中生物安全危险因素的分析[9]，利用阳离子聚合物 PB 浓缩样本，结合病毒快速分离培养，有助于提高检测效率，缩短检测周期。

经过上述实验，成功建立了简单易行的病毒气溶胶采集体系，并用于安全柜内病毒学实验操作气溶胶采集的研究。实验结果表明此气溶胶采样体系具有可行性，为有效采集气溶胶检测分析提供了有力支持。在模拟病毒气溶胶的主动发生中，在距离管口 20 cm 组采集器 1 的 PCR 检测和病毒培养检测对比结果中可以看出，病毒培养可见明显的绿色荧光，而 PCR 未能检测到病毒核酸。提示进行病毒气溶胶收集和检测时联合应用培养方法和PCR 方法可提高检测结果的可靠性。在模拟振荡病毒液的操作中，在距离管口 0 cm 处能捕捉到气溶胶的结果，进一步证实涡旋振荡病毒液后可产生大量的气溶胶，提示进行涡旋振荡操作后，要静置一段时间后再打开盖子，避免气溶胶的产生。在模拟剧烈吹打的操作中，在气溶胶采样器中未检测到病毒，这可能是由于吹打操作产生的气溶胶较少，超过了本研究中使用的采样体系的采样限度。

在病原体分离培养或临床样本等的操作过程中，对样本进行移液、振荡、摇动、倾倒等操作时，除了会产生肉眼看不见的直径小于 5 μm 的气溶胶，也可能产生直径在 5 ～ 10 μm 的液滴，从而造成台面交叉污染，甚至对人体造成潜在危害[10]。在研究中模拟剧烈吹打和振荡等操作后，在 0 cm 组平行于采样器放置的用于采集沉降病毒颗粒的培养皿中都检测到病毒。此结果进一步提示实验人员在安全柜内开展实验时，应严格遵守生物安全实验室通用准则，规范个人的操作行为。

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ObjectiveTo establish viral aerosol collection system and to evaluate the hazards of dangerous operations, Andersen microbial air sampler was used and two most frequently operations i.e. pipetting or vortex liquid containing viruses were mimicked, by using a recombinant adenovirus expressing green fluorescent protein (GFP) as a model.

MethodsThe recombinant adenovirus expressed green fluorescence protein (rAdvGFP) model viruses were aerosolized using the aerosol generator and sampled by the andersen microbial air sampler. The captured chambers of the sampler were put on the position with 0 cm, 10 cm and 20 cm horizontal distance to the aerosol generator. Viral particles were collected for total 5 minutes (mins) after the artificially produced aerosols for 30 seconds (sec). When mimicking the dangerous operations, 10 ml culture medium contained viruses in 50 ml screw tube was used and chambers of the sampler were put on the position with 0 cm and 10 cm horizontal distance to the tube. The viruses were pipetted violently by using pipettes and aerosol was sampled for 5 mins. When mimicking viruses vibration, the tube was vortexed at the highest speed on the vortex for 1 min and sampled for 2 mins after opening the cap of tube, then snapped the lid on before vortexed again for 30 secs and sampled total for 5mins. The medium in the tube was collected, enriched and cell-culture-propagated on HEK 293 cells. Nucleic acids were tested by using PCR method. Viral propagation was checked by observed GFP expression using fluorescent microscope.

ResultsThe dishes and sampler of 0 cm, 10 cm and 20 cm group showed green fluorescence after the artificially produced aerosols. When mimicking pipetting violently, the 0 cm dishes recovered model viruses, but no model viruses were detected in 10 cm dishes and 0 cm and 10 cm sampler. When mimicking vibration, model viruses were recovered from dishes and samplers at 0 cm group and 10 cm dishes, while no viruses were captured from dishes and samplers at 10 cm group.

ConclusionsBy using rAdvGFP model viruses, a system focus on viral aerosol collection and detection was established. The system facilitate to assay the risk of dangerous operations on aerosol generation and to make the standard operating procedures in biosafety cabinet based on such evaluations.

【Key words】Air microbiology; Virology; Safety management; Risk assessment; Biogenic aerosol;

Author Affiliation: State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering, Institute of Pathogen Biology (IPB), Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS), Beijing 100730, China

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(5):342-347

*同为第一作者

Corresponding Author:REN Li-li, Email: renliliipb@163.com www.cmbp.net.cn

基金项目：国家卫生行业科研专项（200802021）

作者单位：100176 北京，中国医学科学院病原生物学研究所病毒基因工程国家重点实验室（陈岚、任丽丽、王健伟）；100041 北京比赛福生物安全技术有限公司（车红）

通讯作者：任丽丽，Email：renliliipb@163.com

收稿日期：2010-6-22

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.05.003

Study on the viral aerosol sampling by using Andersen microbial air sampler

CHEN Lan, CHE Hong, REN Li-li, WANG Jian-wei

【Abstract】