移植物抗宿主病的细胞治疗

郝 磊综述，陈幸华审校

(第三军医大学新桥医院血液科，重庆 400037)

异基因造血干细胞移植是目前治疗血液系统恶性疾病的有效方法。以前认为其成功机制在于移植前后的化疗或放疗对肿瘤细胞的杀伤作用。目前一致认为，供体T细胞可以诱导杀死恶性细胞，即移植物抗白血病反应(GV L)，是异基因造血干细胞移植成功治疗血液系统恶性疾病的关键所在。但是，供体淋巴细胞在杀死受体恶性细胞的同时，可以识别受体细胞表面的主要组织相容性抗原和次要组织相容性抗原，损害受体正常组织，即移植物抗宿主病(GVHD)。GVHD是导致异基因造血干细胞移植患者发病和病死的主要原因，成为阻碍移植成功的关键因素。

理论上，寻找与受体人白细胞抗原(HLA)配型相合的供体是预防GVH D发生的根本措施，然而即使HLA相合的同胞供体移植，也会因受体次要组织相容性抗原的识别导致GVHD的发生。当前，GVHD的预防性治疗包括移植物T细胞去除(TCD)和免疫抑制剂的应用。免疫抑制剂具有强烈的不良反应，TCD显著降低了供体T细胞的有利作用如增强植入、控制机会性感染和抗肿瘤效应。这些措施的应用在控制GVHD的同时，也削弱了GVL效应，使恶性肿瘤复发率增高。GVHD和GVL效应的有效分离是异基因造血干细胞移植需要解决的关键问题，成为医学研究的焦点。本文对GVHD的发生、发展以及目前有望解决这一难题的细胞治疗进行综述。

1 GVHD的发生机制

发主GVH D的3个条件:(1)移植物必须是有免疫活性的细胞;(2)移植物供者缺少宿主带有的同种杭原;(3)宿主不对移植物产生有效的免疫反应。GVHD的发生、发展主要分为3个阶段:(1)造血干细胞移植前的预处理包括化疗和放疗，虽然可以最大程度地杀灭宿主体内的肿瘤细胞，但同时造成其他组织如胃肠道、肝脏等的损伤，导致炎性细胞因子 TNF-α、IL-1、IL-6等大量释放。这些细胞因子增强宿主主要组织相容性复合体抗原(M HC)、黏附分子以及趋化因子的表达，还可以提高供者T细胞异源反应性的敏感度。经损伤的胃肠道进入机体的细菌脂多糖(LPS)进一步加重了炎性细胞因子的释放。(2)在宿主抗原提呈细胞(APC)或非 APC直接提呈以及供体APC的间接提呈抗原的作用下，供者的 T细胞表面受体(TC R)识别APC表面的M HC-抗原肽分子后发生交联(第一信号)，同时APC表面共刺激分子如CD80和CD86等和T细胞表面CD28分子结合(第二信号)，在双信号的刺激作用下，T细胞激活、增殖、分化为效应 T细胞和记忆T细胞。(3)表达组织特异性黏附分子和趋化因子受体的抗原特异性T细胞迁移至表达多种黏附分子和趋化因子的外周组织，即GVHD的靶器官如皮肤、胃肠道和肝脏等。Th1型细胞分泌的细胞因子不仅诱导细胞毒性T淋巴细胞(CT L)和NK细胞的激活，还进一步激活单核吞噬细胞系统，增强炎性细胞因子的再次释放，同时一氧化氮(NO)的释放也增加。因此，除了CTL和NK细胞介导的Fas/FasL途径和穿孔素/颗粒酶途径对GVHD靶器官造成直接损伤外，非特异性炎性细胞因子也促进了器官特异性病理变化。

2 基因多态性和GVHD

对于相关和无关异基因造血干细胞移植，GVHD的发生主要与HLA不合有关。一项最大的关于供受体之间HLA相合的分析表明:HLA-A、HLA-B、HLA-C和 DRB1不相合时，病死率显著增加[1]。除了已经确认的HLA-A和HLA-B不相合可以导致GVHD以外，临床数据表明，不同 HLA-C和HLA-B等位基因，因表达异源反应性NK细胞表面KIR抑制性受体的配体，参与单倍同一性无关HSCT的GVHD和GVL效应，KIR配体不相合时，特别是急性髓细胞性白血病，GVHD的发生率降低，总体生存率提高。虽然HLA完全相合是成功移植的最佳条件，但是大多数患者无法得到配型完全相合的供体，识别可允许不合的特异性H LA等位基因，将有利于多数需要异基因造血干细胞移植的患者。

尽管采用高分辨率HLA分型，急性GVHD仍然是HLA相合异基因造血干细胞移植病死率的主要原因。此时，供体T细胞识别与之有差异的宿主次要组织相容性抗原(m HAg)，m HAgs是与主要组织相容性复合物结合的多态性肽，来源于细胞内蛋白，可以普遍表达或造血系统限制性表达。移植前、后大量细胞因子合成，即“细胞因子风暴”。大多数细胞因子基因包含遗传性多态性，多态性是一些短核苷酸序列，呈现可变数量的重复(可变数量的串联重复或微卫星)或单个核苷酸多态性。位于基因启动子转录结合位点，改变基因转录，从而调节炎性刺激导致的细胞因子的产生。因此，健康人群中存在细胞因子表达量的差异。研究最早的是TNF和IL-10基因多态性与发生急性GVHD危险和严重度之间的关系[2]。TNF是急性GVHD过程中上调的重要细胞因子，IL-10拮抗TNF的释放及功能。在HLA相合的异基因造血干细胞移植中，推测高表达人群浓度增高的TNF-α促进了GVHD的发生，由于IL-10的低表达，不能完全下调GVHD反应。许多研究表明关于TNF和IL-10基因多态性以及受体基因和GVHD的关系具有生物学意义。与GVHD相关的其他细胞因子基因多态性包括IL-6基因启动子功能多态性、IFN-γ内含子微卫星多态性以及IL-1基因家族多态性。

已经证实其他非 HLA编码的基因如维菌药物D受体(VDR)和雌激素受体(ER)对急性GVHD的发展也会产生影响，VDR内含子8区和ER内含子1区的多态性与GVHD的发生以及异基因造血干细胞移植后患者总体生存有关。

3 细胞治疗和GVHD

3.1 间充质干细胞(MSC) Friedenstein等首次报道在骨髓基质中存在干细胞，随后很多研究证实采用Friedenstein的方法分离得到的M SC可以向成骨、成软骨、脂肪细胞、肌细胞、星形胶质细胞、内皮细胞和肺上皮细胞分化。MSC缺乏特异性表面标记，不表达 CD45、CD34和 CD31等造血和内皮细胞表面标记。据估计，其占骨髓有核细胞数的0.01%～0.001%。人MSC与胸腺上皮有共同的表面标志，它们表达与T细胞相互作用的黏附分子包括有 VCAM-1、ICAM-1及LFA-3，推测MSC可能对T细胞发育及免疫调节发挥作用。

很多动物实验和临床研究都证实异基因造血干细胞移植时同时输注供体或第三者来源的MSC可以降低GVHD的发生率及严重程度。Gurevitch等的研究发现BALB小鼠在接受B6小鼠骨髓移植时，同时植入包括供鼠MSC在内的骨髓块，其发生GVHD的危险度与没有接受移植的对照组相比显著降低。患急性淋巴细胞白血病的9岁男孩，进行骨髓移植后70 d出现Ⅳ度急性GVH D，免疫抑制剂无效，73 d时静脉输注其母亲骨髓来源MSC(2×106个/kg)，220 d时GVHD的症状完全消失，患者出院[3]。Lazarus[4]的临床研究发现，46例患血液恶性疾病的患者行骨髓或外周血干细胞移植的同时，移植体外培养的MSC，13例患者(28%)出现Ⅱ～ Ⅳ度急性 GVHD，无病生存率达到53%。然而在最大的2项前瞻性研究中，Ⅱ～Ⅳ度和Ⅲ～Ⅳ度急性GVHD的发生率分别为44%～64%和12%～26%。深入证实MSC的有利作用有待进一步的随机试验。

输注外源性MSC可以降低GVHD的发生率，其机制可能在于MSC对免疫细胞的抑制作用，包括T细胞、B细胞、NK细胞和APC。MSC分泌或免疫细胞受MSC刺激而分泌的一些可溶性分子包括肝细胞生长因子(HGF)、前列腺素 E2(PGE2)、转化生长因子β(TGF-β)、吲哚胺 2，3 二氧酶(IDO)、NO和IL-10等参与了体外MSC的抑制作用[5-7]。最新研究还发现MSC分泌的HLA-G5是其发挥抑制作用所必需的[8]。根据MSC接受的刺激不同，比如异源性决定子、膜蛋白、有丝分裂剂或细胞因子等，分泌的可溶性分子也不同。细胞接触方式也可能参与了抑制，如 MSC表面B7H1的表达[9]。

3.2 NK细胞 NK细胞是骨髓来源的大颗粒淋巴细胞，约占人外周血淋巴细胞总数的5%。是机体发挥天然免疫功能的重要组分，同时对获得性免疫也起到一定调节作用。和 T、B淋巴细胞不同，NK细胞不表达抗原特异性受体，其功能的发挥主要依赖于NK细胞表面一系列抑制性和活化性受体，调节细胞的活性。NK细胞主要受自体MHCⅠ类分子特异性受体负性调节，当此受体不发生交联时，靶细胞被裂解。因此，NK细胞的杀伤对象主要是一些不表达或低表达M HCⅠ类分子的靶细胞。同样，当接触不相合的异源靶细胞时，NK细胞识别自体MHCⅠ类分子发生障碍，从而引起异源性反应(“丢失自我”学说)。NK细胞表面重要的抑制性受体包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和杀伤细胞凝集素样受体 CD94/NKG 2A。由于所有个体均表达CD94/NKG 2A的配体HLAE，因此，表达CD94/NKG2A的NK细胞不发生异源性反应。在人类，根据MHCⅠ类分子α1螺旋羧基末端的氨基酸不同，KIR识别3组 HLA等位基因配体，即 HLA-C组 1(Asn80)、HLA-C组2(Lys80)和HLA-Bw4。NK细胞异源性反应发生于KIR配体不相合时。

在F1H-2d/b→H-2b移植动物模型中，移植前输注供体抗受体异源性NK细胞后，受体可以接受含有超过致死剂量30倍的异源T细胞的骨髓移植物，但却没有GVHD的病理证据，推测原因是表达H-2d特异性Ly49A-G2受体不表达H-2b特异性Ly49C/I受体的供体NK细胞被激活从而杀死受体APC，而受体APC是启动GVHD的重要细胞。体外实验证实异源性NK细胞可以杀死急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤细胞等[10]。临床前期动物模型中，输注异源性NK细胞可以消除NOD/SCID鼠移植的人AM L细胞。

单倍体相合移植时，在移植物抗宿主方向(GVH)KIR配体不相合情况下，供体NK细胞识别的自身HLAⅠ类分子在受体中没有表达，抑制活化信号缺失，从而被激活，产生异源性反应。在KIR配体不相合的57例成年AM L患者，复发率降低的同时，GVHD的发生率也明显降低。将HLA和KIR基因分型与NK细胞异源反应性功能鉴定相结合寻求单倍体相合供者的概率从30%增加到60%[11]。Ruggeri[12]研究还发现，85例接受单倍体移植的AML患者中，输注供者异源反应性NK细胞组的GVHD明显降低。100多例单倍体相合移植治疗AML的研究证实，NK异源反应是患者生存改善的独立预测因子。无关供体移植时，NK细胞异源反应增强了GVL效应[13]。

3.3 CD4+CD25+T细胞(T reg) 调节性CD4+CD25+T细胞(Treg)正常在胸腺中发育成熟，组成性表达CD25(IL-2受体α链)，在人类和鼠CD4+细胞中占5%～10%，MHCⅡ类分子的表达在其发育中发挥重要作用，调节自身免疫过程。Treg特异性表达转录因子FoxP3，与细胞发育及抑制功能有关，它的突变导致免疫失调。大量证据表明共刺激分子和细胞因子在T reg发育过程中发挥重要作用，但其具体机制不清楚。T细胞对自身抗原的耐受是在胸腺内发育过程中经过克隆删除或诱导无能形成的，一些自身特异性T细胞可以逃逸到外周，此时需要外周免疫耐受机制控制T细胞反应。Treg保证了外周免疫耐受机制的正常发挥。在许多不同的Treg缺陷的动物模型中，观察到多种T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，且可以通过输注Treg得到防治。体外实验已经证实，当受到抗CD3单克隆抗体或异源APC刺激时，T reg呈现低反应性。Yamazaki[14]证实，体外Treg可以抑制混合淋巴细胞反应(M LR)。

发生异源性或自体GVH D的一个重要原因是外周免疫调节系统缺失，从而下调异源反应性或自体反应性T细胞的能力下降。因此，外周免疫调节系统的重建对GVHD的防治起关键作用。有学者比较了接受供体总T细胞和缺乏Treg的T细胞的受鼠中GVH D的发生率，结果表明移植物中缺乏Treg时显著加速GVHD诱导的死亡，当共输注T细胞和等量的Treg时，显著推迟，甚至阻止了GVHD的发生。只有供体来源而非受体来源的Treg产生这种效应。Masteller等[15]比较了异源抗原扩增的T reg和多克隆Treg对受鼠GVHD发生的影响，结果表明，接受后者的受鼠脾脏、肺和肝脏出现组织学GVHD征象，而接受前者的受鼠没有或仅残留GVHD征象，因此，相对多克隆Treg，抗原特异性 Treg治疗GVHD更加有效。但这并不意味着Treg对免疫反应的抑制是抗原特异性的，它的活化需要TCR的激活，活化的Treg在体外是以抗原非依赖性方式作用的。抗原特异性T reg可以避免大量输注多克隆Treg造成的一些不良反应，如降低对肿瘤和感染的免疫等。在A20白血病模型中，CD8+而非CD4+T细胞体外可以裂解A 20细胞，而体外培养的T reg对CD4+T细胞的抑制作用更强[16]。所以，Treg抑制GVHD的效应比GVL的效应更强，它能将二者有效分开，但这需要进一步证实。

临床BMT中 Treg对GVHD的调节作用的证据很少，Miura[17]的研究表明，与没有 GVHD临床症状的患者比较，发生GVHD的患者外周血淋巴细胞Foxp3 m RNA表达水平显著降低，急性 GVHD患者中，Foxp3 m RNA表达水平和GVHD的严重程度负相关，认为CD4+CD25+Foxp3+T细胞在调节异源免疫反应中发挥重要作用。Sakagucki[18]研究了CD62L+和CD62-两个不同CD4+CD25+调节性T细胞亚群与急性GVHD致死率的关系发现，当与供者CD4+CD25-T细胞一起移植时，仅CD4+CD25+CD62L+调节性T细胞亚群具有阻止严重组织损伤和保护受者免受致死性急性GVHD的作用。CD62L是非常重要的淋巴细胞归巢受体及T细胞分化中的细胞表面分子。在移植早期，CD4+CD25+CD62L+调节性T细胞亚群较CD4+CD25+CD62L-调节性T细胞亚群能更多地进入宿主肠系膜淋巴结及脾脏内，调节性T细胞能够进入这些致病性自身反应性T细胞聚集场所的能力是其具有避免急性GVH D发生的先决条件。

对Treg调节免疫反应的机制提出了很多观点，包括释放调节性细胞因子(如IL-10、TGF-β)，诱导T细胞无能以及反应性T细胞的凋亡等[19]。一致认为细胞之间的接触是发挥其调节功能所必需的。

3.4 其他细胞 正常成熟树突状细胞(m DCs)是刺激T细胞免疫的强力APC，而正常不成熟树突状细胞(iDCs)参与外周T细胞免疫耐受的诱导。由于iDCs在炎症刺激下可以转变成m DCs，所以，不适于临床上免疫疾病的治疗。有学者分离出人和鼠调节性DCs(rDCs)，表达高水平的MHC分子，但共刺激分子表达量很低，激活异源反应性T细胞能力减弱，相反可以强烈诱导T细胞免疫耐受，即使在炎症条件下，其免疫调节功能也不会降低。当骨髓移植后输注宿主M HC相合rDCs时，急性GVHD导致的致死率显著降低，对GVL的效应没有明显影响，rDCs对急性GVHD的控制在于体内诱导T细胞耐受以及对效应T细胞的直接抑制，且对CD4+T细胞的诱导免疫耐受的作用大于CD8+T细胞，而CD8+T细胞主要参与GVL效应，因此，输注rDCs对GVL效应的影响不大。

影响GVHD和GVL的T细胞功能上至少存在4种，包括CD4+辅助性 T细胞(Th1和Th2)和 CD8+细胞毒性T细胞(Tc1和 Tc2)，Th1和 Tc1主要分泌Ⅰ型细胞因子(IL-2和IFN-γ)，而Th2和Tc2主要分泌Ⅱ型细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)。Ⅰ型和Ⅱ型细胞因子的平衡对GVHD的发生、发展起到重要作用。Fowler和Gress[20]发现动物实验中，输注体外扩增的Th2/Tc2表型T细胞可以促进HLA不相合异源移植物的植入，降低GVHD的发生率，同时Th2/Tc2细胞通过穿孔素和颗粒酶途径杀死肿瘤细胞。人特异性Tc1和Tc2在体外已经扩增成功，将进一步推进临床应用。

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