止痢草提取物抗菌作用及其应用研究进展*

陈月明,王水明

(1.苏州市畜牧兽医站,江苏苏州 215000;2.上海绿昌生物技术有限公司,上海 200000)

止痢草提取物抗菌作用及其应用研究进展*

陈月明1,王水明2

(1.苏州市畜牧兽医站,江苏苏州 215000;2.上海绿昌生物技术有限公司,上海 200000)

现在在饲料中滥用药物的程度非常惊人,其原因是国家允许使用的药物添加剂的抗药性已非常严重,滥用药物的结果将会危及我们人类自身的健康。止痢草提取物的主要成分是能被肠道吸收的天然芳香型杀菌物质,这种能杀灭或抑制(耐药的)致病菌(尤其是革兰阴性致病菌)的杀菌物质,既能单独使用,又能与所有的抗菌药物联合使用,并起到明显的协同和相加作用。由于止痢草提取物在体内不会残留,也不会出现抗药性,所以不需要停药期,也不需要经常轮换用药,无任何使用风险,是替代抗生素的理想产品。

药物残留;抗药性;止痢草提取物;芳香型天然杀菌物质

目前,多数中国大陆生产的肉、蛋、奶和水产品的出口受限,出口受阻的障碍之一就是产品中的药物残留超标严重。造成药物残留超标的主要原因:¹饲料厂滥用药物;º养殖场滥用药物;»上市前没有严格执行停药期等。

而造成饲料厂和养殖场被迫长期滥用药物(有些养殖场已到了离开药物就无法养殖这种境地)的原因是,大肠埃菌、沙门菌、链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌等主要病原菌对许多药物产生了严重的耐药性,而且耐药性菌株正在逐年增多,这使得抗生素对细菌性疾病的防治效果越来越差,药物的抗药性越来越严重。

王红宁等报道,猪致病性大肠埃希菌的菌株主要表现为多重耐药性,以对4种～13种抗菌药物表现抗性为主,共占95%;猪致病性沙门菌的所有菌株都表现出对3种以上的抗生素有耐药性,其中有17株表现出对6种以上抗菌药物耐药,占试验菌株数的60.7%;鸡致病性大肠埃希菌对16种抗生素表现5种及以上耐药性的菌株占分离菌株的97.8%。菌株敏感性最高的药物依次是头孢唑啉、新霉素、庆大霉素、磺胺和妥布霉素,而这5种药物或5种药物组合是治疗和预防鸡大肠埃希菌病的首选药物。

陈焕春对规模化猪场大肠埃希菌的耐药性进行了调查,从湖北、河南、江西、安徽、浙江等省的33个猪场分离出致病性大肠埃希菌发现,分离菌株对15种药物均有不同程度的耐药性,多数为耐6种药物以上的菌株(80株),占供试菌株的71.14%(刘梦元等,2004)。

张秀英等从江西、辽宁、广东3个省分离到204株大肠埃希菌,试验结果表明,分离菌对四环素的耐药性最高,为92.2%,对其它绝大多数抗菌药物的耐药性都在60%以上。

现在国家允许在饲料中使用的药物添加剂的抗药性也已非常严重,导致药物添加剂在饲料中的实际用量被迫越来越大,据我们了解,有的已达最高允许添加量的5倍～10倍,其滥用程度非常惊人。更为严重的是,为了保证效果,有的饲料厂和养殖场则干脆偷偷地使用国家明令禁止使用的药物和价格高昂的最新型人用药物。

鉴于上述原因,很多国家已经在法律上禁止使用抗生素作为饲料添加剂,没有禁用的国家也立法严格限制使用并严格规定停药期。欧洲国家已经禁止使用(1999年禁用,2006法律上全面禁止)。其直接结果是,国际大型饲用抗生素公司重组剥离业务或将生产和业务转向中国和越南等发展中国家。

早在欧洲禁用抗生素之前,许多国家的科学家们就做了大量的研究,他们发现许多天然的植物提取物能很有效地杀灭或抑制大肠埃希菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌等病原菌,而且在抗菌方面,以大蒜、止痢草和芥菜的提取物的抗菌能力为最强。

为此,在1985年到1999年的15年时间里,英国美瑞康公司及其合作伙伴对止痢草进行的大量研究,并培育出的活性物质含量丰富的止痢草新亚种(产品商品名:好力高)。该新亚种植物提取物的活性成分及产品可以用于动物和人类,具有抗菌、杀菌功能,可以有效地对抗引发炎症、感染、下痢及球虫等的病原菌,从而可以保证动物肠道健康,防治动物下痢,提高动物生产性能和养殖效益,并被美国FDA认定为/公认安全性0(Generally Recognized As Safe,GRAS)产品。

1 止痢草提取物(OEO)的抗菌机理

1.1 植物提取物的抗菌机理

尽管植物提取物添加剂抗菌作用机制的已经进行了很多研究,但是其详尽的作用机制仍没彻底明了。由于植物提取物所用的植物的种类繁多,其活性成份也有很多。因此,植物提取物添加剂抗菌机制可能有多种机制,这些作用机制包括:¹破坏/降解细胞壁;º破坏细胞质膜;»破坏细胞膜蛋白质结构;¼使细胞内容物泄露;½使细胞质凝聚;¾减弱质子运动力。

需要说明的是,所提出的几种作用机制并非都是独立的,可以会相互影响。一种机制的反应可能受到另一种反应物或生成物的影响。植物提取物及其活性成分一个重要的特点是其疏水性,这使得植物提取物及其有效成分可以让细胞膜和线粒体上的磷脂结构分开,破坏细胞结构,增强细胞膜通透性,从而导致细胞内离子和其他物质的泄露。尽管胞内有些物质泄露后的细胞仍然可以存活,但大量细胞内容物或者重要离子或分子的泄露会导致细胞死亡。也有研究发现,利用茶叶提取物对大肠埃希菌的抑菌实验中,细菌在裂解之前就已经死亡;利用肉桂提取精油及其活性成分的研究也发现,肉桂提取精油及其活性成分可以抑制产气肠杆菌的氨基酸代谢中的脱羧酶的活性。

1.2 OEO及其活性成分(香芹酚和百里香酚)的抗菌机理

研究发现,凡是抗菌性强的植物提取物中都含有比较高的酚类化合物,例如香芹酚、百里香酚和丁子香酚等。这样看起来有理由相信,这些酚类物质的抗菌机制是相似的,尽管单个组份的化学结构不同其准确的抗菌的作用机制也有略有不同。研究者对止痢草中的两个主要成分香芹酚和百里香酚的作用机制研究报道最多。香芹酚和百里香酚化学结构相似,但羟基在苯环上的位置不同。膜穿孔和膜黏合被认为是首要作用模式,导致细菌细胞膜渗透性提高及胞内生命物质的外泄,从而损害细菌酶系统,导致微生物的死亡。一致的研究结果表明,香芹酚可以通过挤压开磷脂的脂肪酸链,在细菌细胞膜上形成很多小管道,从而让细胞质中的离子从细胞内流出细胞外。已经证实,止痢草中的主要成分香芹酚可以使金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌细胞中的磷酸分子泄漏。Helander等研究了止痢草中的香芹酚和百里香酚如何对大肠埃希菌O157和沙门菌产生杀灭作用时发现,这些酚类活性物质可以使细胞膜破裂和胞内物质外溢。这表明萜类和苯丙素类能因它们的亲脂特性而穿透细胞膜进入细胞。另外研究发现,止痢草中的抑制或杀灭微生物的特性与其亲脂性质(如:存在的功能基团)和芳香族的化学结构有关。此外,香芹酚和百里香酚是酚类物质,而酚类物质往往能导致细菌细胞壁蛋白的变性,从而改变细菌细胞壁原有的结构和特性,造成细菌的死亡。

正是这种原始的杀菌方式,就决定了细菌无法对其产生抗药性。而且由于香芹酚和百里香酚等成份在动物体内的最终代谢产物是水和二氧化碳,所以也不会出现抗药性。

除去抑制细菌自身细胞的生长之外,香芹酚也有可能抑制细菌内毒素的分泌。体外试验结果表明,香芹酚可以抑制蜡状芽孢杆菌分泌可以导致腹泻的内毒素。对于香芹酚抑制细菌内毒素分泌的机制有两种可能:一是如果内毒素分泌是一个主动过程,那么香芹酚有可能能导致细胞没有足够的ATP或PMF把内毒素转运到体外;另一可能是,香芹酚能抑制细菌的生长使其速度减慢,这意味着,细菌细胞使用了所有的可利用的能量为了存活,而没有能力再产生内毒素。

有趣的是,如果使用完整的植物提取物,其抗菌功能要比用主要成分的混合物要大的多。这种结果也说明了非主要活性成分也起到了重要的作用,并可能与主要活性成分有叠加效应。止痢草提取物中的两种主要活性成分香芹酚和百里香酚在杀灭金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌方面有叠加效应。已经证明,香芹酚和它的合成前体p2百里香素在抗菌方面也有协同作用,研究发现,提纯的p2百里香素抗菌作用很微弱,但是它比香芹酚更能够让细菌的细胞膜膨胀,通过这种机制,p2百里香素能够帮助香芹酚更容易进入细菌体内,所以香芹酚和它的合成前体p2百里香素在抗菌方面通过这种机制达到协同和叠加作用。

U ltee等研究也发现,在1 mmo l/L以上的浓度(取决于温度)时,纯品香芹酚能降低芽孢杆菌的发育能力指数,但这种现象在OEO试验并没有出现,这可能是与OEO中所含有的30多种活性物质能保护该芽孢杆菌有关。

2 OEO抗菌的体外试验

长期以来,OEO被认为具有抗微生物的活性。大量科学研究证明,其专利产品OS(好力高)对致病性的大肠埃希菌、沙门菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、链球菌、白色念珠菌等均能有效抑制或杀灭。由于其良好的抗菌杀菌特性,OS可以保障动物肠道健康和防止下痢,尤其难得的是OS对一些耐药菌株也有很好的杀灭作用。另外,OS对病原菌和肠道微生物的选择性抑制,也许会对肠道微生物平衡起到一定作用。

3 影响OEO抗菌性能的因素

OEO抗菌活性取决于植物的品种、成分组成和精油的浓度、目标微生物的种属和浓度、加工工艺和储藏环境等。

3.1 品种

止痢草在国内外均属常见品种,我国民间将其用于防治下痢和肠炎。在所有影响OEO的因素中,最重要的是植物的来源、部位、生长阶段以及气候和生长环境(温度、土壤、肥料)、蒸馏和储藏条件。OEO中抗菌作用的成分,以亲脂性的烃链和亲水性的功能团为最重要。其主要活性成分是香芹酚和百里香酚以及它们各自的生物合成的前体:g2萜品烯和p2异丙基苯。不同品种之间的主要成分浓度差异很大,尤其是香芹酚(0.43%～79.58%)和百里香酚(0.44%～31.8%)。专利产品OS(好力高)是使用在希腊高原低温环境中进行种植的Greek oregano、viz.OriganumvulgareL.ssp.植物作为制备原料。该专利植物属于高精油品种(含量＞2%),其精油产量是我国普通野生品种的5倍～7倍,而其提取物中的主要杀菌、抗菌成分的浓度也是普通品种的3倍左右,所以由该植物品种制备的产品OS的杀菌、抗菌成分的浓度是普通品种的20倍左右。

3.2 植物提取精油中的活性物质及其比例

OEO的成分是复杂的天然挥发性二级代谢产物,是将植物通过干馏和蒸馏的方法而分离产生的。精油的主要成分是单萜烯和倍半萜烯,包含碳水化合物、醇、醚、醛和酮,具有芳香气味和生物学功能。其抗菌活性的大小顺序为:苯酚＞醛＞酮＞醇＞醚＞烃基,其中活性最强的是苯酚。百里香酚和香芹酚的羟基能与酶的活性中心形成氢键,因此含有苯酚的精油成分具有抗微生物的最高活性,同时它们的抗菌谱也是最广的。来源于O.vulgaresubsp.H irtum(通常是希腊止痢草)植物的精油提取物以其高苯酚含量为特点,专利产品OS中含有85%左右的香芹酚和百里香酚以及它们的前体g2萜品烯和p2异丙基苯,是普通品种的3倍以上。

研究表明,决定植物提取精油活性的不仅是组分的含量,各组分之间的比例也至关重要。很多研究者试图在植物提取精油的功能性质和它们的单独成分之间建立关联,其他的研究者则比较植物提取精油不同的成分及其组合,试图发现其间可能的增效效应。Trinas博士研究了OEO中不同活性组分比例对病源菌生长抑制与杀灭的影响,发现OEO中的香芹酚与百里香酚的比例在30 B 1左右的时候效果最佳。

4 OEO的其它功能

4.1 OEO抗氧化作用的体外试验与动物实验

研究表明,OEO的百里香酚和香芹酚有很强的抗氧化性质。在评估OEO的抗氧化性质研究中发现,与其它植物提取物(如:百里香、薄荷、马郁兰和熏衣草)比较,OEO对75 e猪油的稳定保存最有效。Farag等比较了植物提取精油抗氧化性质与其结构之间的关系发现,百里香酚结构苯环上的羟基为脂肪氧化中第一步产生的自由基提供氢离子,以延缓过氧化过程,被认为是百里香酚高抗氧化活性的原因。在动物实验研究方面,Youdim和Deans发现,添加百里香酚组白鼠比对照组白鼠维持较高的多不饱和脂肪酸的含量,尤其是肝、脑、肾和心脏磷脂中的C20 B 4n26和C22 B 6n23。同时,对家禽实验研究也取得类似结果,并且还认为,OEO能在肌肉和腹部脂肪中发挥抗氧化的作用是主要是由于OEO中的抗氧化成分进入细胞膜引起。

4.2 OEO可以提高食欲

除了具有抗微生物和抗氧化性质外,OEO还在人类食品中充当香料。百里香酚也被用作食品调味剂。OEO提取物的的香料功能可以用于对仔猪断奶阶段的原料变化引起味道和气味的变化进行统一。OEO作为香料在猪营养中的使用可以刺激猪的舌咽神经从而提高唾液分泌及提高猪的食欲。

4.3 OEO可以抗有害的真菌和抗球虫

近年来的研究表明,止痢草提取物对抑制动物和人类免疫能力的几种真菌如新生隐球菌、红色青霉菌和白色念珠菌也有很强的抗菌杀菌能力。此外,OEO还有很强的抗球虫特性。

4.4 OEO不会影响乳酸菌等有益菌在肠道的定植与繁殖

可能是由于OEO中所含有的30多种活性物质的保护,实验证明,OEO不会影响乳酸菌等有益菌在肠道的定植与繁殖,这也是OEO优于抗生素的关键原因之一。

5 OEO在动物生产上的应用

鉴于止痢草提取物具有无药物残留和无抗药性等的特性,所以目前其已成为国内外的许多饲料厂和养殖场生产无抗绿色肉蛋奶和水产品时,优先选用的抗菌产品。

5.1 OEO对鸡生产性能的影响

OEO可以提高肉鸡生长和降低死亡率。Bot2 soglou等研究发现,当OEO添加量在20mg/kg～200mg/kg时,试验组比对照组体增重效果明显,并且采食量增加。Lee等在4周的肉鸡试验中结果显示,日粮中添加200ppm的OEO尽管在增重和采食量方面差异不显著,但可以有效改善饲料报酬。

研究认为,日粮中添加OEO改善的料肉比与改善饲料利用效率和(或)改变胴体品质有关系,OEO不仅对肠道微生物有影响,还可能影响营养物质的利用。有试验表明,OEO可以提高肉鸡增重16%,降低死亡率44.5%。

5.2 OEO对猪生产性能的影响

研究表明,OEO不仅可以通过抗菌或杀菌维持动物肠道健康,防治下痢,同时能够帮助消化和提高食欲,并且还可以作为天然饲料添加剂来促进生长和改善繁殖性能。Gertenbach和Bilkei试验表明,在断奶后仔猪日粮中添加1 000 mg/kg的OEO能显著提高体增重和改善猪的健康;饲料中添加OEO可以促进生长猪的采食、日增重和提高饲料利用率。

此外,OEO可以给处于繁殖期的母猪的健康带来积极的影响。OEO的抗菌、消炎、抗氧化和促进食欲等功效可以提高母猪的采食、降低死淘率,并改善后续的生长性能。Khajarern认为,OEO中香芹酚和百里香酚对消化道内皮层的成熟有促进作用,能加速肠道微绒毛内皮的更新,减少病原菌在消化道内皮上的殖附,从而改善母猪对营养物质的吸收。据推测,OEO对母猪繁殖力的影响是由于稳定了肠道的微生物,减少了不良微生物的数量,减少或延缓了免疫反应和减少子宫白细胞的活性,提高了母猪的健康,从而改善分娩后的免疫系统。

5.3 OEO在水产上的应用

近年来,科学家对OEO在水产动物上的应用也进行了研究。在虾和鱼类生产中应用的研究结果均证实,专利产品OS不仅能有效抵抗病原菌(如对水产动物危害很大的嗜水气单胞菌和哈维氏弧菌等)对水产动物的侵害,而且能增强动物自身的免疫能力。在一些科研院校所进行的小型试验以及企业内大型的生产试验证明,OS可以提高水产动物的成活率,降低疾病发病率,从而提高鱼和虾类的生产性能和养殖效益。

2[1] 金立志.植物提取物在动物生产中的应用研究及发展前景[J].中国畜牧杂志,2007,43(20):11217.

[2] 巩 霞,程学慧.饲用抗生素抗药性研究:现状与未来[J].中国畜牧杂志,2007,43(22):26232.

[3] 王红宁,刘书亮.规模化猪场致病性大肠杆菌、沙门氏菌药敏区系调查[J].西南农业大学学报,2000,13(S):84290.

[4] 刘梦元,吴 斌,刘建杰,等.规模化猪场大肠杆菌的耐药性监测及血清流行病学调查[J].中国兽医学报.2004,24:16218.

[5] 张秀英,吴好庭,赵 晖,等.部分鸡场大肠杆菌对抗菌药物的耐药性[J].中国兽医学报,2005,25(4):4222424.

Progresson Antibacterial Effect and App lication of Zhilishen Extract

CHEN Yue2m ing1,WANG Shui2ming2

(1.Suzhou Animal H usbandry and Veterinary Station,Suzhou,215000,Ch ina;2.Lvchang Biotechnology Co.,Ltd.Shanghai,200000,China)

The degree of drug abuse isextraordinarily striking for the reason of the drug resistance inmedi2 cine additive,in which used the range of national permitted.Itw ill endanger the health of hunman.The essential components in Zhilishen ex tract is natural aromatic bacteriocidal substance which can kill or re2 strain pathogenic bacterium w ith ablity of drug resistance,especially for the Gram2negative bacterium.It can be used not on ly separately but also associatedly w ith all the other antibacterials,and has the apparent effects of synergism andaddition.The problem of drug resistancew illbe solved as Zhilishen extract is not residue and itw illnot need w ithdrawal time and alternate drugs usually.Zhilishen extract is abest product that used w ithout risk and also can rep lace of antibiotics.

drug residue;drug resistance;Zhilishen extract;natural aromatic bacteriocidal substance

S853.7

A

100725038(2010)0420263204

2010203222