多杀性巴氏杆菌检测、鉴定和分型研究进展

高明燕,徐 步,赵宝华,范建华,龚建森,刘学贤

(中国农业科学院家禽研究所,江苏扬州 225003)

多杀性巴氏杆菌检测、鉴定和分型研究进展

高明燕,徐 步,赵宝华,范建华,龚建森,刘学贤

(中国农业科学院家禽研究所,江苏扬州 225003)

多杀性巴氏杆菌(Pm)可以引起多种畜禽疾病,给养殖业造成巨大的经济损失。为了系统的了解Pm检测、鉴定和分型技术的发展,论文主要对Pm的分类地位、鉴定和分型的传统方法以及分子生物学方法,诸如种特异性 PCR、荚膜分型PCR、产毒素 Pm 的PCR鉴定、16 S rRNA基因测序法、DNA杂交、大分子图谱、限制性酶切分析和核糖体分型、随机扩增DNA片段多态性、脉冲场凝胶电泳及其他各种基因分型技术等进行了综述。

多杀性巴氏杆菌;检测;鉴定;分型

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是重要的人兽共患病病原菌之一,可以引起多种畜禽巴氏杆菌病,如禽霍乱(Fowl cholera)、猪肺疫、猪进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)、牛和水牛的出血性败血症(Hemorrhagic septicemia,HS)、兔鼻瘘(Snuffles)等。人类也可以感染,主要是由动物咬伤或抓伤引起。Pm宿主范围比较广泛,引起的疾病表现各异,常常给养殖业造成重大的经济损失。免疫接种是预防和控制畜禽巴氏杆菌病的有效方法,但由于Pm本身血清型的复杂性和免疫机制不甚明了,至今国内外尚缺乏理想的疫苗。近年来,随着分子生物学技术和Pm应用基础研究的发展,特别是在对Pm的检测、鉴定和分型方面。

1 多杀性巴氏杆菌的分类地位

在2005年出版的伯杰氏细菌学手册(第2版)上,根据16 S rRNA系统发育对许多细菌进行了重新分类。多杀性巴氏杆菌仍然属于巴氏杆菌属、巴氏杆菌科。巴氏杆菌科位于变形杆菌门、伽马变形杆菌纲的巴氏杆菌目下。巴氏杆菌科的细菌种属有了新的变化,包括6个属,依次为巴氏杆菌属、放线杆菌属、嗜血杆菌属、曼氏杆菌属、隆派恩杆菌属、海豚杆菌属等;原名溶血性巴氏杆菌改为溶血性曼氏杆菌,是曼氏杆菌属的代表种;鸭疫里杆菌属于新建立的里氏杆菌属,归于黄杆菌科。而巴氏杆菌属有20多个种,严格意义上的巴氏杆菌包括P.multocida、P.canis、P.stomatis、P.dagmatis及未命名的species B;但最重要的代表种是多杀性巴氏杆菌(P.multocida)。根据对海藻糖和山梨醇发酵模式的不同,Pm又分为3个亚种,分别为多杀亚种、败血亚种和杀禽亚种。

2 Pm检测、鉴定和分型的传统方法

2.1 细菌分离和表型特征

Pm属于苛养菌,对营养要求较高。血琼脂或巧克力琼脂培养比较好。国外一般用50 mL/L或100 mL/L小牛或羊血琼脂培养,还有许多研究者尝试过很多别的培养基,如脑心浸液琼脂(含50 mL/L去纤维绵羊血)、改良Knight's培养基、Pm双选择培养基、葡萄糖淀粉琼脂以及大豆胰酪蛋白琼脂。国内常用的是改良马丁琼脂(添加40 mL/L小牛血清、1 g/L的血红素)。

分离病料以患病动物的内脏,如心血、肝脏、脾脏为好,但检测带菌动物或潜伏期动物,常用口咽棉拭子或扁桃体棉拭子。另外,有时需要通过接种小鼠进行细菌富集。

Pm的菌落虹彩、形态、细菌形态大小、以及培养和生化特性等表型特征可以参照2005年出版的伯杰氏细菌学手册(第2版)。2007年,Christensen H等[1]又重新扩展了Pm生化反应的项目表,也可用于Pm的准确鉴定。

2.2 半自动/全自动细菌鉴定系统

近年来,半自动/全自动细菌鉴定系统迅速发展,如法国梅里埃的API系统、VITEK系统、美国BIOLOG系统、英国SENSITITRE系统、BD公司的Phenix System系统、DadeMicroScan公司的MicroScan系统等多种产品。Vera Lizarazo Y A等[2]研究发现API 20E能鉴定95%的菌株,但是只有60%的菌株可以确定到种的水平;API 50CHB存在更大的差异;API ZYM系统在该菌的鉴定中帮助比较大。Boot R等[3]用API系统对巴氏杆菌科的细菌进行鉴定,发现全自动细菌鉴定系统比传统方法更省事更节省时间,但会出现非特异性引起的假阳性结果,而且仪器本身及其耗材价格都比较高。国内用细菌鉴定系统进行的研究很多,但在巴氏杆菌方面的应用还比较少。总之,采用半自动/全自动细菌鉴定系统能够鉴定Pm,但要确定Pm血清型,进行流行病学调查还是达不到要求。

2.3 血清学分型方法

100多年以来,研究者对Pm血清学分型进行了各种尝试,如凝集和吸附试验、特异性凝集反应、被动血凝试验、小鼠被动保护试验及琼脂扩散沉淀试验等。Carter G R[4]用间接血凝试验将Pm荚膜型分为A、B、D、E 4个血清型;后来又从火鸡上鉴定出F型。早期的研究者将特定的荚膜型与特定的宿主疾病及地理位置联系在一起,但随着研究的深入,这种模式越来越不可靠。B型菌株通常引起亚洲牛和水牛出血性败血症;E型菌株只在非洲患出血性败血症牛上分离到;但近年来,研究者发现,无论在非洲还是世界其他地区E型菌株都很少分离到;现在非洲牛流行的出血性败血症也以 B型为主。禽类主要以A型为主,但在火鸡上分离到F型;B、D型也在家禽上分离到,但不致病或症状轻微。引起猪进行性萎缩性鼻炎的主要是产毒素的D型;引起猪肺疫的主要是A型;引起牛出血性败血症主要为B型。这与我国学者对多杀性巴氏杆菌的荚膜分型的研究结果基本一致。

1961年,Namioka S等以1 mol/L的盐酸处理细菌,制成菌体抗原,进行凝集反应,将菌体抗原分为12个型;但该方法经常会出现交叉反应和自家凝集,没能广泛应用。现在公认的菌体血清学分型采用的是1972年Heddleston K L建立的耐热抗原琼脂扩散沉淀试验,直到今天,仍然没有新方法取代该试验。该法将Pm菌株分为16个(1～16)血清型。猪Pm分离株以1型、2,5型为主。美国和加拿大等主要来源于火鸡禽霍乱的血清型为1型、3型、4型;国内禽Pm分离株以1型为主,其次还有1,3型、1,14型、3,4型、14型等[5]。传统血清学分型方法虽然费时费力,但要从事Pm病原学、流行病学以及分子生物学分型等方面的研究,仍然是以传统血清学分型方法为基础。

2.4 以抗体为基础的其他检测方法

除了荚膜血清型、菌体血清型是以抗体为基础的分型方法外,利用抗体来检测巴氏杆菌的还有ELISA、对流免疫电泳等方法。Foged N T等建立了针对纯化的多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocidatoxin,PMT)单抗的夹心ELISA来检测产毒素Pm,并采用该法对感染萎缩性鼻炎的猪进行了血清学调查。如今检测PMT商业化的ELISA试剂盒已经广泛用于PAR的诊断和监测。针对Pm引起的出血性败血症,Prado M E等[5]利用Pm外膜蛋白作为包被原建立的ELISA方法来检测小牛母源抗体水平。在禽霍乱诊断方面也建立了多种ELISA方法,成熟的商品化ELISA试剂盒已经广泛用于大规模的家禽血清调查[4]。鲍娟等[6]采用对流免疫电泳的方法来鉴定猪源Pm血清型,发现该法特异性高,重复性好,而且快速,准确,操作简便,不需特殊设备,易于在生产实践中推广。

3 Pm分子生物学检测、鉴定和分型的方法

Pm的检测、鉴定和分型长久依赖于实验室分离培养;细菌纯化后,通过诸如形态学、糖类发酵模式和血清学特征等表型来分类;然而培养条件能够影响这些特征的表达,从而影响菌株表型鉴定方法的稳定性和可靠性。近年来,随着分子生物学的发展以及Pm70菌株的全基因组和多个单个基因序列的测定,研究人员根据细菌的遗传特征建立多种基因检测、鉴定和分型的方法。

3.1 Pm全基因组测序法

May B J等[7]报道了禽源Pm70菌株的全基因组序列,发现Pm70基因组为闭环单股DNA,共有2 257 487 bp,2 092个基因,预测编码2 014个蛋白,6个rRNA操纵子,57个tRNA;其中1 814个开放阅读框(ORF)可以找到与其他细菌同源的蛋白或多肽,而有200个ORF是Pm所特有的。

3.2 16 S rRNA基因测序法

细菌的rRNA有23 S rRNA、16 S rRNA和5S rRNA。16 S rRNA序列含有进化速率不同的区域——可变区与恒定区,以及多个重复的核苷酸三联体序列;不同种属的细菌,其16 S rRNA序列有差异。根据这些特点,16 S rRNA常被用于细菌种属的鉴定和分类。Dey S等[8]对来自牛、水牛、猪、绵羊和山羊等宿主Pm B∶2血清型分离株的16 S rRNA序列进行比较分析表明,来自不同宿主Pm分离株间16 S rRNA序列同源性高达99.9%,而且引起不同动物败血症B∶2血清型分离株种系发生关系很近。Corney B G等[9]采用16 S rRNA测序的方法对Pm进行了分析,具有很高的敏感性和特异性。国内亓英芳等[10]、贺英等[11]分别对禽、猪等Pm分离株的16 S rRNA序列进行了分析,并证实以16 S rRNA为靶基因设计的PCR方法可以快速、准确地鉴定Pm。

3.3 Pm种特异性PCR

PCR方法采用的是设计1个针对基因组某保守基因的引物,进行体外核酸扩增,然后用琼脂糖凝胶电泳的方法来分离该扩增片段,并进行大小和序列分析。多杀性巴氏杆菌种特异性PCR(PM-PCR)对Pm的快速诊断意义重大。Townsend K M等[12]利用基因消减的方法对Pm进行研究发现了Pm基因组上一个特有区域,针对该 Pm特异性DNA序列设计引物,所有的Pm都可以扩增出一个460 bp的片段,即PM-PCR。利用该方法成功用于检测猪扁桃体棉拭子的Pm,36个样品中有16个阳性,而分离到17个菌株。接种小鼠,有5个阳性结果没有分离到Pm,这说明PCR方法敏感性更高。Kalorey D R等[13]采用PM-PCR对印度感染Pm的猪进行了成功的诊断,并表明该方法可以快速、敏感、特异的对Pm分离株进行鉴定,无需纯化样品。国内研究人员对禽、猪、牛等动物分离的Pm用该种特异性PCR进行了验证,都取得了比较确切的诊断效果[14-16]。

3.4 荚膜分型PCR

Townsend K M 等[12]研究表明,A 、B、D、E、F菌株的生物合成位点的基因分别是hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD 等 ,它们编码的荚膜多糖成分已经通过核磁共振检查研究证实。Pm A型菌株的荚膜多糖成分是透明质酸;B型菌株的荚膜多糖是由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖组成;D型菌株的荚膜物质是一种类似于肝素的多糖。针对这几种荚膜合成基因位点设计引物,扩增出的片段大小分别为1 044 、760 、657、511、851 bp;由此建立了荚膜分型PCR。该方法也得到国内研究者的证实[14-16]。传统的荚膜分型技术比较繁琐,由于体外培养荚膜会消失,所以需要先回归动物,再重新分离细菌制备荚膜抗原进行间接血凝实验;Twonsend K M等[12]建立的荚膜PCR分型技术已经基本替代了传统方法。

3.5 产毒素Pm的PCR鉴定

PM T是引起猪PAR的重要毒力因子,编码该毒素的是toxA基因。产毒素Pm的PCR方法的建立来自toxA基因的序列测定和克隆。早期的PCR是针对toxA基因的HindⅢ-HindⅢ1.5 kb区建立的,具有很高的特异性,但是该方法没有得到广泛应用[4]。Lichtensteiger C A等扩增了toxA基因上一个846 bp的片段,此方法区分产毒素和非产毒素Pm菌株的特异性和敏感性都很高;Dziva F等[17]证实此方法重复性很好。汤细彪等[18]根据产毒素多杀性巴氏杆菌的toxA基因序列,设计了2对特异性引物,扩增出两个片段,分别为864 bp和447 bp,建立了一种能直接从猪鼻拭子中快速检测产毒素Pm的套式PCR方法,该方法最低能检出26 cfu,并且快速、方便和灵敏,适合临床进行大规模病原学检测。诸多研究表明PCR诊断技术在猪PAR检测和控制研究项目中已经成为一个可靠的方法[4]。

3.6 其他基因的PCR

根据Pm的基因特点,研究人员还建立多种用于检测Pm的PCR,如最近发展起来的5′Taq核酸酶试验[9]在Pm野毒株的检测方面远远优于以培养为基础的方法。Miflin J K等建立的PCR,扩增了禽和猪Pm分离株的一个1 432 bp大小的片段,并认为可以用于禽霍乱和猪巴氏杆菌病的诊断;然而Christensen H 等[19]研究表明P.canisbiovar 2型和P.avium也呈阳性,说明该PCR方法的特异性比较低。其他还有针对psl基因、tRNA基因间隔区及转录调节因子等设计的PCR方法,这些方法都促进了Pm鉴定和检测研究的发展。

3.7 DNA杂交

该技术的首次应用是为了诊断猪PAR的toxA基因,设计的5个杂交探针中只有2个被认为有诊断价值[4],但是没有证据显示该探针在野毒扩增方面的成功范例。荧光或生物素标记的探针用于toxA基因的扩增被认为有更高的敏感性和特异性。基于猪PAR的二重诱因,研究人员建立了一个可以同时检测Pm和支气管败血波氏杆菌的双色杂交试验;并用该试验评价了84个猪PAR的临床样品分离物。直接检测混合培养物中的Pm可以不必纯化该病原菌,从而节省了时间。Mbuthia P G等[20]用荧光标记的rRNA建立了原位杂交试验,并用于评价禽霍乱感染鸡的组织以及人工感染猪的肺组织的检测。随着16 S rRNA序列的测定,采用Cy3或荧光标记的一个区域可以将Pm从巴氏杆菌科其他成员中分离出来。研究者认为该方法可以成为Pm诊断的一个替补工具。

3.8 大分子图谱

外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)图谱是提供相对快速的菌株之间关系的方法之一。Pm外膜蛋白H和W在凝胶上的电泳移动速率可以作为PAR分离株分型的基础。Pm的Omp H和热休克蛋白(OmpA)提供了另一种Omp分型图谱。依据这两个外膜蛋白和其他次要蛋白的电泳分离图谱将100个禽 Pm分离株分为19种Omp型[21]。荚膜血清型和特异Omp型之间有很强的相关性,表明Omp图谱能够成为一个鉴别Pm菌株的非血清学技术,而且,通过外膜蛋白分型可以发现野毒株和疫苗株之间的微小差异。虽然蛋白电泳迁移率的差别能够作为一个分型的方法,但是具有相同速率的非相关蛋白可能会造成结果误判[4]。

3.9 限制性酶切分析和核糖体分型

限制性酶切分析(restriction endonuclease analysis,REA)是限制性内切酶特异性切割细菌DNA,将不同的菌株切割成不同大小的片段,然后通过琼脂糖凝胶电泳分离开来;再用染色剂对凝胶中的片段染色,根据酶切片段差异的大小对不同的菌株进行分型。REA已被证明是细菌流行病学研究的一个很有价值的分析手段,也是巴氏杆菌病流行病学调查应用最频繁的方法之一,可以鉴别同种菌体血清型或荚膜血清型的分离株[4]。Rimler R B等[22]用该方法对巴氏杆菌分离株进行分析,表明REA具有很高的重复性,不受表型性状表达差异的影响,而且比传统方法具有更好的敏感性和特异性;所使用的限制酶的不同而鉴别水平有所差异,限制性内切酶HpaⅡ和HpaⅠ最适于Pm的研究。

核糖体分型是先用限制性内切酶消化基因组DNA,接下来将消化的片段转移到硝酸纤维素膜上与标记的16 S rRNA或23 S rRNA探针杂交。菌株之间特异性模式的产生及相似性的比较主要取决于所采用的限制性内切酶的种类。Dziva F等[17]采用限制性内切酶HpaⅡ对津巴布韦Pm分离株进行了分类,发现该方法可以将1个PAR Pm分离株分为4个不同的核糖体型,每个型还可以分成更细的亚群;从津巴布韦分离的菌株与从丹麦分离的一个产毒素参考株归于一群;其结果与用RAPD方法分析得到的结果一致。结果表明,对Pm采用核糖体分型能够有效区分不同的菌株,而且进一步证实限制性内切酶HpaⅡ在Pm核糖体分型中能够得到比较理想的结果。

3.10 随机扩增DNA片段多态性

随机扩增DNA片段多态性(random amplification of polymorphic DNA,RAPD)是一种分子遗传标记技术;其原理是根据PCR技术,由人工随机合成DNA引物,先进行2个循环的随机扩增,再以低循环扩增的DNA片段作为模版进行多个循环扩增,从而产生一些离散的、可重复的、能反映基因组特征的一些扩增片段。该方法快速、简单,可以在一般实验室完成,因此被越来越多的用于流行病学调查以及实验室常规分析和耐药菌克隆传播的分析。Dziva F等[16]用该法对核糖体不能分型的Pm进行研究发现,该方法区分Pm分离株的可靠性比较高。刘加波等[23]采用该技术对9个广西禽Pm分离株和3个参考株的DNA进行了多态性分析,结果显示,广西流行的菌株呈现多样性,与标准强毒株存在差异,为疫苗的选择提供了参考依据。

3.11 脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis,PFGE)基本原理是根据不同大小的DNA片段在一定大小孔径的琼脂糖凝胶中,由于电场的不断变化而改变其泳动方向从而将其分离。该方法具有准确、稳定和可重复性等优点,已经成为细菌分子流行病学调查和细菌溯源的一个“金标准”。利用该方法对患巴氏杆菌病的猪分离株进行研究表明,从育种猪口咽分离的D∶2血清型存在多样性,但是育种猪和仔猪Pm分离株之间没有遗传相关性;从人和猪分离的产毒素Pm菌株的PFGE特征揭示它们之间存在重要的DNA多态性,但宿主间无明显相关性;研究者对引起出血性败血症的同一血清型菌株进行PFGE分析,可以检测出菌株间的差异,包括地理相关性;从北美分离的引起出血性败血症的B型菌株与亚洲分离株明显不同,而且同一地区的菌株存在高度同源性[24]。Gunarwardana G等[25]在分析鸟源Pm时发现PFGE方法比基因组重复序列PCR技术的鉴别能力更强。但是该技术缺点也很明显,如需要设备比较昂贵,费时,不宜实验室大量样本的分析。

3.12 其他基因分型技术

用于Pm的其他基因分型技术还有扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、基因芯片技术、基因组重复序列PCR(repetitive extragenetic palindormic PCR,REP-PCR)等。

4 结语

尽管从临床样品可以直接进行PCR对Pm做快速检测,但是传统的表型鉴定技术有时同样能够提供比较确切的检定结果。当然,将表型特征与基因型方法结合在一起进行分析,结果将更加确切。更加权威的鉴定结果通常需要公认的参考菌株做对照,相关信息可以从美国和英国菌种保藏机构ATCC、NCTC的网站上以及中国菌种目录[26]一书中获得。

Pm检测、鉴定和分型技术所取得的进步,促进了Pm相关种的分类地位和种群结构的鉴定及Pm流行病学追踪和地方菌株传播途径的研究,而且还为巴氏杆菌的致病性和免疫原性分析研究提供很好的技术支持。相关的检测、鉴定技术还需要不断完善,以便能够完成商业化开发,从而得到更为广泛和更加便利的推广应用。除了禽Pm菌株,其他 HS和PAR等菌株的全基因组序列的信息也需要补充。总之,简单易行、廉价、快速的鉴定与分型技术在巴氏杆菌病的诊断和控制中起到了十分重要的作用,可以预见Pm的检测、鉴定和分型技术将会得到进一步优化,从而为巴氏杆菌病的诊断、监测、预防控制提供更加全面系统的理论与技术保障。

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Progress on the Detection,Identification and Typing forPasteurella multocida

GAO Ming-yan,XU Bu,ZHAO Bao-hua,FAN Jian-hua,GONG Jian-sen,LIU Xue-xian

(Poultry Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Y angzhou,Jiangsu,225003,China)

Pasteurella multocida(Pm)is responsible for major animal diseases of economic significance in animal husbandry.This paper reviewed and evaluated the advancement of methods of detection,identification and typing to Pm,which include definition of the taxonomical position of Pm,the sequence detection of complete genome and 16S rRNA,species-specific PCR,capsular PCR,PCR detection of toxigenic Pm,DNA hybridization,macromolecular profiling,restriction enzyme analysis and ribotyping,random amplification of polymorphic DNA,pulse-field gel electrophoresis and other typing technology based on genome,and so on.

Pasteurella multocida;detection;identification;typing

S852.612

A

1007-5038(2010)01-0067-06

2009-08-15

江苏省家禽科学研究所青年科学基金项目(S018)

高明燕(1978-),女,山东德州人,助理研究员,硕士,主要从事禽病学研究。