金环蛇毒细胞毒素抗肿瘤研究现状的分析

肖月 罗小玲

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病。在我国每年至少有160万新增癌症患者，而且每年约有130万人死于癌症，随着人口数量的增加和人口老龄化的加快，肿瘤发病率和死亡率也呈上升趋势。因此肿瘤的防治工作一直是我国医药卫生领域的重点，寻找安全有效的药物是肿瘤治疗中的重要课题[1]。我国在蛇毒抗肿瘤方面的研究已达国际先进水平[2]。本文将目前国内外有关金环蛇毒细胞毒素抗肿瘤的报道作简要综述。

1 蛇毒抗肿瘤组分分类

按作用机制可将蛇毒抗肿瘤组分分为4类：(1)抑制肿瘤组织内的血管增生以及肿瘤细胞间的粘附，称为解离素；(2)直接作用于肿瘤细胞膜，有溶胞作用，称为细胞毒素；(3)诱导细胞凋亡组分；(4)酶及蛇毒因子等。

细胞毒素是蛇毒中一类强碱性、高毒性的多肽。迄今已从眼镜蛇科的粗毒中分离出20多种细胞毒素，对这些毒素的分析研究表明，细胞毒素具有以下的理化特性：(1)由60～63个氨基酸残基组成的含大量疏水性残基，带有较多正电荷的强碱性多肽；(2)由4个二硫键交叉连接的单链组成；(3)相对分子量6000～7000；(4)具有三指结构，二级结构分析显示缺乏螺旋，主要由折叠组成；(5)耐高温，耐强酸、强碱，能对抗水解酶，提示其作用与酶活性无关[3]。

尽管金环蛇毒的心脏毒素与眼镜蛇毒心脏毒素在生理功能上有相同的作用，但两者的氨基酸组成有较大的差异，因此我们也同样称之为类心脏毒素(cardiotoxin-Like)。金环蛇毒中心脏毒含量较高，占全毒的40%以上(46%)且分子量较小，对热(60℃)2h不失活，对酸(10%醋酸)稳定，比较易于纯化，同时又是一个生物活性较高的毒蛋白，对正常细胞有一定作用，也可采用局部给药法将金环蛇毒心脏毒注射于人肿瘤生长处，杀死癌细胞，或者将它与单克隆抗体结合在一起，制备免疫毒素，直接作用于靶细胞。因而，它是一种有潜力值得探讨的抗癌细胞药物。

2 金环蛇毒研究进展

由于金环蛇毒造价昂贵，所以较对于眼镜蛇毒的研究而言国内外对于金环蛇毒的研究较为局限。迄今为止，国内外的研究主要集中在神经毒、细胞毒和磷脂酶A2等组分上，对L-氨基酸氧化酶[4]的神经毒毒理作用的研究、神经毒素及类心脏毒素的结构与功能，以及金环蛇毒对肿瘤细胞产生细胞毒性作用的文献均尚未见系统报道[5]。

国内广西医科大学等曾对金环蛇粗毒做过一些酶活性测定及抗凝血、镇痛作用的测定，但还未见有分离纯化的报道[6]，金环蛇毒成分复杂，既含有多种酶又含有大量具有不同生物学活性的蛋白质与肽类，具有多方面的药理作用，如抗炎、抗血小板聚集、镇痛、抗肿瘤等。随着蛇毒毒理学、药物学、生物化学和分子生物学的发展，近年来国内外学者越来越重视蛇毒抗肿瘤作用的研究,报道金环蛇毒在体内体外都具有抗肿瘤作用[7]。

2.1 金环蛇毒心脏毒素作用机制的研究

1972年Lin Shiau等[8]从台湾金环蛇毒中分离出2种心脏组分，它们的功能属于膜活性多肽，但其氨基酸组成、分子量、等电点等与一般研究较多的细胞毒素有较大差别而被称为类心脏毒素。1978年Lu和Lo[9]报道了其中1种类心脏毒素的氨基酸序列。作为毒性成分之一的细胞毒存在于眼镜蛇科和南非唾蛇属等蛇毒中。60年代，人们从多种眼镜蛇科毒蛇中分离纯化到多个细胞毒，它们有多种不同的生物效应，如溶血作用、杀细胞作用、去极化作用、抗菌作用和心脏毒作用。1967年Braganca[10]等从眼镜蛇毒中分离到对吉田肉瘤生长有抑制作用的眼镜蛇毒细胞毒素，1968年Brisbois[11]从眼镜蛇毒中分离到对艾氏腹水癌细胞具有抑制作用的组分。1975年Lin Shiau等用CM-纤维素分离金环蛇毒得到两个心脏毒组份A和B，并进行了有关化学及药理学性质的研究，证明其药理作用与眼镜蛇毒细胞毒相同，对Hela、KB细胞和吉田肉瘤有细胞毒活性[12]。近10年来，有关眼镜蛇毒细胞毒、响尾蛇毒细胞毒、响尾蛇毒蛋白(CT)与细胞毒蛋白(CD)结合物作为抗癌试剂对多种动物实验性肿瘤细胞及多种人癌细胞在体内及体外产生细胞毒性作用曾相继为人们重视和报道。

2.2 金环蛇细胞毒素的氨基酸组成研究

在蛇毒细胞毒素中，绝大部分已知细胞毒素含有58～61个氨基酸，它们都是单链的蛋白质，在分子内含有4对二硫键。孔健强、吴秀荣等[13]从广东金环蛇蛇毒中分离、纯化了1个组分第XII峰，并称它为细胞毒素XIII。它由116个氨基酸残基组成，且含有6对二硫键。它的氨基酸组成与最近Lu Hsieng-sen和Lo Tung-bin发表的Miami金环蛇类心脏毒素VIB的组成极为相似，也属于长链细胞毒素。广东产金环蛇细胞毒素XIII的氨基酸组成表明它是由116个氨基酸残基组成，其中含有6个胱氨酸、14个芳香族氨基酸、22个酸性氨基酸、15个碱性氨基酸。由于整个毒素分子呈碱性，所以有相当数量的酸性氨基酸是以酰胺的形式存在于分子中。该细胞毒素与昆明动物研究所、北京生物物理研究所发表的金环蛇类心脏毒B的氨基酸组成有相当程度的差异。与Lu Hsieng-sen和Lo Tung-bin[14]发表的Miami金环蛇类心脏毒素VIB的氨基酸组成极为相似，仅差2个氨基酸残基。

广西产金环蛇蛇毒中类心脏毒素分为A、B两部分，2种毒素氨基酸组成十分相似，通过凝胶过滤，测得它们的分子量分别为15900和12100。它们N端的2个氨基酸顺序完全相同，为Gly.Leu…。经羧肽酶A降解测得它们的C端顺序为……Ala.Cys.Tyr。等电聚焦测得它们的等电点分别为8.8和9.2。紫外吸收光谱显示它们279nm分别是11.7和12.7[15]。

2.3 金环蛇细胞毒素抑癌作用研究

关于眼镜蛇毒细胞毒素对癌细胞的抑制作用的确切机理尚不清楚,有学者认为细胞毒素破坏细胞的作用机理主要是依赖毒素分子有较多的碱性基团与细胞膜表面磷脂的酸性基团结合,进而由毒素分子内高含量的疏水侧链与脂层作用,从而扰乱双层膜达到破坏细胞膜的作用[16]。雷丹青[17]等通过采用MTT法检测CTX对人鼻咽癌细胞株、淋巴瘤细胞株、S180癌细胞株、人宫颈癌细胞株和卵巢癌细胞株体外细胞毒作用得出结论，细胞毒素对体内外癌细胞杀伤作用差异大的原因在于进入体内, 其作用即被Ca2+所拮抗,作用减弱,加入EDTA后Ca2+被络合,疗效就提高,因此S180载瘤小鼠生命延率从23%提高到40%，但不可能把体内生理所需的Ca2+都络合,这提示改良给药方式,维持CTX长期低浓度发挥作用或利用CTX进行肿瘤的免疫导向治疗,从而减轻CTX的不良反应,是取得良好疗效的关键。

3 结束语

肿瘤药物治疗是一个经久不衰的话题，目前为止还没有找到更好的药物根治它。传统的治疗恶性肿瘤的手段以化疗、放疗、手术切除为主，但这些传统方法对病人愈后效果均不是很好，对病人伤害很大，很难恢复。寻找副作用小又可以更好遏制恶性肿瘤的药物是国内外学者潜心研究的着眼点，为此生物治疗药物纳入了学者们的视线。新型的抗肿瘤药物为分子靶向性治疗药物，分子靶向性治疗药物能够对癌细胞的增殖、浸润、转移的重要靶分子发挥作用,最大限度地阻碍肿瘤发生、发展和转移。因分子靶向性治疗药物的副作用常常很少,且可间接抑制肿瘤的增殖、进展,长期维持与宿主的共存状态,在生存期的延长和改善生活质量方面,对于高龄肿瘤患者来说临床意义深远[18]。

蛇毒抗肿瘤这一崭新的话题开启了生物治疗恶性肿瘤的新篇章，这一领域的研究还在不断完善、不断更新中。用蛇毒及其有效组分抗癌的研究国内外早已展开[19-20],但由于眼镜蛇毒中成分复杂,大多数组分直接进入体内都可能对机体产生严重毒性反应,直接用全蛇毒或其某一天然成分(如对细胞有直接溶解作用的组分C)的体外抗癌虽确有一定效果,但临床实际应用风险很大,因此,这些研究成果很难在临床应用和推广。国内有学者报道眼镜蛇毒通过口服途径给药,眼镜蛇毒、蟑螂毒可抑制小鼠移植性肝癌的生长,而且无明显的毒副作用[21]。但对于有消化道破损的病人,用蛇毒直接口服就有使蛇毒直接进入血液循环的危险,不利于在临床推广应用[22]。

4 展望

虽然金环蛇毒细胞毒素抗肿瘤研究尚处于摸索阶段，但其潜在的开发价值与应用价值值得学者们投入更大的精力潜心研究。相信在不久的将来，国内外学者对金环蛇毒细胞毒素抗肿瘤的研究会有更多、更广、更深的发现。充分利用我国丰富的蛇资源，并将其应用于生物治疗领域是每一位医学科研者神圣的使命。

[1]孙晋民.蛇毒抗肿瘤成分的筛选及对人肿瘤细胞抑制作用的研究[J].中国优秀博士学位论文全文数据库,2003.

[2]孙德军,王伟,杨同书.蛇毒解整合蛋白抗肿瘤研究进展[J].中国老年学杂志,2006,26(7):1006-1009.

[3]张正明,芮景.蛇毒抗肿瘤作用研究进展[J].国际肿瘤学杂志,2006,33(5):354-357.

[4]魏继福,杨海伟,乔丽雅,等.金环蛇L-氨基酸氧化酶诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的研究[J].中国现代应用医药,2006,22(2):251-256.

[5]董跃伟,徐天瑞,王婉瑜,等.金环蛇毒心脏毒对S180_EAC腹水癌细胞的细胞毒性作用[J].中国现代应用药学,2001,18(4):271-273.

[6]肖昌华,张洪基,雷克健.金环蛇蛇毒类心脏毒素的纯化及生化分析[J].动物学研究,1981,2(1):49-54.

[7]李牡艳,韦世秀,刘成军,等.金环蛇毒体外对人类小涎腺腺样囊性癌细胞的抑制作用[J].广西医科大学学报,2007,24(4):567-569.

[8]Lin S Y,Huang M C,Lee C Y,et al.Isolation of cardiotoxic and neurotoxic principles from the venom of Bungarus fasciatus[J].Taiwan Yi Xue Za Zhi.1972 Jun,71(6):350-357.

[9]Lu H S,Lo T B.Complete amino acid sequence of a new type of cardiotoxin of Bungarus fasciatus venom[J].Int J Pept Protein Res,1978 sep,12(3):181-183.

[10]Braganca B M,Patel N T,Badrinath P G,et al.Isolation and Properties of a cobra venom factor selectively cytotoxic to Yoshida sarcoma cells.Biochim Biaphys Acta[J].1967 Apr 25,136(3):508-520.

[11]Brisbois L,Rabinovitch-Mahler N,Gillo L,et al.Isolation from cobra venom of a factor inhibiting glycolysis in Ehrlich ascites carcinoma cells[J].Experientia,1968 Jul 15,24(7):673-674.

[12]Lin Shiau Y,Huang M C,Lee C Y,et al.A study of caidiotoxic principles from the venom of Bungarus fasciatus(Schneider)[J].Toxicon,1975 Jun,13(3):189-196.

[13]孔健强,吴秀荣.金环蛇蛇毒的分离及其毒性组分的药理研究[J].药学学报,1983,18(2):97-103.

[14]张耀时,吴兴陆,陈远聪,等.广东金环蛇细胞毒素的化学组成和部分一级结构[J].动物学研究,1981,2(4):27-32.

[15]雷克健,刘兢,赵文.广西产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒中类心脏毒素物理化学性质的研究[J].生物化学与生物物理学报,1982,14(3):279-285.

[16]Codrea E.Membrane-active Polypeptides from snake venom[J].Cardiotoxins and Haemocytotoxins Experientia,1974,30 (1) :121.

[17]雷丹青,刘绵林,蓝利,等.广西眼镜蛇蛇毒细胞毒素的抗肿瘤作用[J].实用癌症杂志,2004,19(2):127-129,138.

[18]程明荣,芮景.蛇毒抗肿瘤机制研究进展[J].皖南医学院学报,2003,22(3):235-239.

[19]Chaim-Matyas A,Boorkow G,Ovadia M.Isolation and characterization of a cytotoxin P4 from the venom of Naja nigricollis nigricollis preferentially active on tumor cells[J].Bichem Int,1991,24 (3) :415-418.

[20]林振桃,赵路宁,植飞.眼镜蛇毒组分C 对小鼠实验性肝癌细胞生长影响的探讨[J].蛇志,1997,9(1):3-6.

[21]杨冠群,李钦章.并用蛇毒胶囊治疗恶性肿瘤的疗效观察[J].实用中西医结合肿瘤杂志,1995,3(1):6-8.

[22]任先达,张海伟,叶春玲,等.眼镜蛇毒灌胃后的兔血清对人鼻咽癌CNE-2细胞株的影响[J].暨南大学学报(自然科学与医学版),2004,25(4):436-440.