胃癌的表观遗传学研究进展

彭小春 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

魏 蕾 (武汉大学医学院，湖北 武汉 430071)

胃癌的表观遗传学研究进展

彭小春
(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

魏 蕾
(武汉大学医学院，湖北 武汉 430071)

胃癌的发生发展是一个涉及多基因多步骤的复杂过程，包括遗传机制以及表观遗传学修饰两个方面。表观遗传学修饰在胃癌发生过程中的作用越来越受到重视。异常甲基化通过影响基因转录，促基因突变，增加染色体结构的不稳定性等多方面促进胃癌的发生发展。组蛋白的乙酰化影响着抑癌基因的转录，从而在胃癌的发生进展中发挥着重要作用。

胃癌；表观遗传学；DNA甲基化；组蛋白修饰

表观遗传学是指研究非DNA序列变化引起的、可遗传的基因表达改变。表观遗传学的研究对象不是基因组核苷酸序列所携带的遗传信息，而是研究基因表达在时间和空间上的调控问题，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印迹、染色体重塑、基因表达重新编程、X染色体失活等，其中最主要的两个研究内容是DNA甲基化和组蛋白修饰。胃癌的发生发展是多因素、多阶段、多基因共同作用的结果，研究表明胃癌的表观遗传学改变在胃癌进展过程中发挥着重要作用。

1 DNA甲基化与胃癌

1.1DNA甲基化DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，Dnmt)的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上并与其3’端的鸟嘌呤形成mCpG，且在双链对称出现。甲基化特征的遗传主要是通过维持性甲基转移酶(maintenance methyltransferase)实现的，其特点是以双链中互补链为甲基化CG的CpG作为底物，从而保证在子代细胞中有可能恢复亲代的甲基化状态。DNA甲基化异常可分为甲基化增强、甲基化减弱和甲基化酶水平增高三种类型，其中甲基化增强在肿瘤中最常见，与肿瘤的关系比较明确，被认为是肿瘤抑制基因失活的重要途径，研究取得的进展也最多。癌基因多为不充分甲基化，导致重新开放或异常表达；抑癌基因多为过度甲基化，从而表达受抑制，DNA异常甲基化导致肿瘤发生的可能机制如下。首先，在正常情况下非甲基化的CpG岛的高甲基化，可以导致肿瘤抑制基因的失活。其次，DNA甲基化可以促进肿瘤相关基因的突变，因为5-甲基胞嘧啶可自发或在S-腺苷蛋氨酸的作用下引起邻位脱氨而变为胸腺嘧啶，使甲基化的CpG突变为TpG，这是最常见的突变，在抑癌基因p53中也最常见，是肿瘤相关基因甲基化促进细胞恶变的一种机制。近年来胃肠道肿瘤相关基因的研究集中在相关基因启动子区域CpG残基的高甲基化，特别是抑癌基因的研究目前已成为热点。

1.2DNA甲基化与胃癌发生目前研究发现多种基因的甲基化异常与胃癌的发生有关，根据甲基化变化的程度可以分为：①仅在胃癌发生甲基化如GSTP1和RASSF1A基因；②在慢性胃炎、肠上皮化生以及胃腺瘤出现低甲基化的频率高而在胃癌出现高甲基化的频率高如COX-2、hMLH1和p16基因；③在胃癌发生发展的各个阶段表现为相似频率的低甲基化如MGMT基因；④在胃癌发生发展的各个阶段表现为相似频率的高甲基化如APC和E-cadherin基因；⑤随着胃癌的发展表现为甲基化不断增高的趋势如DAPK，p14，THBS1和TIMP-3等基因。

RASSF1基因定位于染色体3p21.3，是RAS相关基因，至少以两种形式在正常人细胞中表达，但在胃癌的癌变过程中仅RASSF1A表观性的灭活。且进一步研究发现RASSF1A的灭活与K-ras的激活是癌变过程当中互相对立的事件，这提示RASSF1A应该是肿瘤细胞凋亡信号通路中K-ras的一个抑制物，RASSF1A的重表达抑制了胃癌细胞的生长，可以证实RASSF1A是肿瘤的抑癌基因[1]。

hMLH1是一种DNA错配修复基因，与癌基因和抑癌基因一样在致瘤过程中起关键作用，它的突变或表达降低会增加受损伤细胞中DNA的突变频率，不仅导致癌基因和抑癌基因的突变率增高，还可导致微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)的发生。Fleisher等检测了65例胃癌的hMLH1甲基化情况与MSI的关系，发现其中18例胃癌有多个微卫星位点突变，为高频率微卫星不稳定性(MSI-H)；8例胃癌仅有1个微卫星位点突变，为低频率微卫星不稳定(MSI-L)；39例胃癌无微卫星位点突变，为微卫星不稳定性阴性(MSI-阴性)。结果显示：77.8%的MSI-H胃癌发生hMLH1基因的甲基化；75%的MSI-L胃癌发生hMLH1基的甲基化；仅23%的MSI-阴性胃癌有hMLH1基因的甲基化。而且，发生hMLH1基因甲基化的胃癌仅表达少量的hMLH1蛋白，而未发生hMLH1基因甲基化的胃癌表达丰富的hMLH1蛋白[2]。这些数据表明：hMLH1基因甲基化可导致DNA错配修复缺陷，并且与胃癌的MSI密切相关。 Leung等的研究不仅证实hMLH1基因甲基化与胃癌MSI-H密切相关，还证实hMLH1蛋白的丢失与浸润性肿瘤的发生密切相关。还发现随着年龄的增加，hMLH1甲基化的频率显著增加，提示其在老年人胃癌的发生过程起着重要作用[3]。 Kang等研究发现hMLH1甲基化可能包含在早期胃癌发展过程中，如hMLH1甲基化在癌组织中出频率为42.2%，比肠化生2.1%和腺瘤11.5%更频繁。研究表明，hMLH1在慢性胃炎、肠化生、胃腺瘤和胃癌的甲基化频率逐渐升高，反映了癌的变化过程[4]。

MGMT(Methylguanine DNA methyltransferase)定位于染色体10q26，编码甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶，是一种DNA修复蛋白，可对烷基化合物损伤的DNA进行修复，而研究发现胃癌由于其甲基化频率低以致于MGMT表达较高，对烷基化疗药物不是很敏感[5]。

研究发现APC/E-cadherin信号通路的失活在胃癌的发生进展中起着重要作用，其中APC基因是位于5q的抑癌基因，其蛋白参与修饰转录活化和细胞周期的调节。通过对胃癌APC基因的分析发现：用特异化甲基PCR(MSP)对胃癌标本和胃癌细胞株的分析发现：82.5%的原发性胃癌，97.5%胃癌患者的癌旁胃黏膜和10个胃癌细胞株APC启动子1A呈高甲基化，而启动子1B却没有发生甲基化。由于甲基化，在10个细胞株中，外显子1A没有出现APC表达，而外显子1B却出现APC表达。说明APC启动子1A甲基化在胃癌形成的早期就出现，可成为有用的生物标记[6]。有研究表明：APC在慢性胃炎、肠化生、胃腺瘤和胃癌中的甲基化频率均较高，在肠化生中可高达80.7%，这说明它可能是胃癌发生的早期事件。E-cadherin在胃癌中的表达与肿瘤的浸润、转移呈负相关。在约50%的未分化型胃癌中，E-cadherin有突变，从而被灭活。Tamura等的研究显示，E-cadherin基因启动子的甲基化可导致其表达降低，而且发生于胃癌的早期，他们用甲基化特异性PCR-SCP及直接测序PCR产物的方法，来研究E-cadherin基因启动子的甲基化情况，该技术可以检测出启动子内所有被甲基化的胞嘧啶。对53例原发性胃癌检测结果显示，51%的胃癌有甲基化，未分化型胃癌的甲基化率(83%)明显高于其他组织类型的胃癌(34%)；早期胃癌与进展期胃癌的甲基化率相似，对4例进展期胃癌和2例早期胃癌的DNA经硫化处理后进行了测序分析，发现这6例胃癌的E-cadherin基因，在靠近转录起始部位的CpG均发生甲基化，经Western印迹杂交检测，证实有4例肿瘤的E-cadherin蛋白表达消失或明显减少[7]。因此可见， E-cadherin基因启动子的甲基化与胃癌密切相关。

p14INK4a/ARF(CDKN2A) 定位于染色体9p21，编码2种不同的蛋白质，一个为细胞周期依赖性激酶抑制剂p16INK4a；另一个产物为其可变读框基因(alter ativereading frame，ARF)编码，产生一个由132个氨基酸组成Mr1390的P14蛋白，p14蛋白能稳定和提高细胞p53水平，增强p53在G1S期和G2M期的限制点效应，最终使细胞阻滞于G1期和G2期。因此p14属于肿瘤抑制基因，具有显著的细胞周期负调控作用。目前认为，恶性肿瘤中p14主要由于p14启动子甲基化而失活。 Iida等发现扩散型胃癌p14启动子甲基化率45.5%。同时，因p14启动子甲基化而失活者，在细胞质中可以发MDM2(murinedoublegene 2)，而且p53表达失活，用去甲基化试剂处理后，MDM2又回到细胞核而且p53也表达[8]。Esteller等对胃癌细胞株的分析发现，7个细胞株中有5个不表达p14 mRNA，对不表达者进一步分析，发现其启动子高甲基化。有研究表明：p14在胃腺瘤和胃癌中的甲基化频率比在胃炎和肠化生中明显升高[9]。

还有些基因的异常甲基化与胃癌有关。CD44 基因定位于染色体11p13，长约50～60kb，由两组外显子(1～20) 组成。一组(由外显子1～5 和16～20 组成) 共同剪切形成转录体，称为标CD44(CD44s)。它编码产生标准型CD44蛋白。另一组为10个变体外显子6～15(v1～v10) 选择性剪切，在5～16外显子之间的一个插入位点插入一般的外显子。含有v 区外显子的CD44 转录子统称为变异型CD44(CD44v)，它编码产生变异型CD44 蛋白。研究表明CD44表达与胃癌发生发展密切相关，CD44基因的异常往往影响CD44蛋白的表达。Satos等通过Northern blotting和RT-PCR技术检测8种胃癌细胞系，发现仅MKN-28细胞系未表达CD44，进而研究发现主要是由于CD44基因启动子区域发生甲基化而抑制了CD44的表达[10]。抑癌基因RUNX3是调控细胞生长信号通路的重要调控因子，研究表明DNA的高甲基化导致其表达过少可能是参与胃癌进展的重要因素[11]。研究发现通过测定来源于42个胃癌患者的组织和8个细胞系中RARbeta、CRBP1和TIG1三种基因的情况，发现7个胃癌细胞系CRBP1基因发生甲基化且CRBP1转录取失活，6个胃癌细胞系TIG1基因甲基化且TIG1转录取失活利用5-aza-2’-脱氧胞苷酸治疗可以恢复两者的转录；42例胃癌标本中RARbeta、CRBP1和TIG1基因的甲基化分别为15例(36%)、14例(33%)和4例(10%)，而在癌旁组织中分别为6例(20%)、0例和1例 (3%)，10例来源于正常健康的年轻人的胃黏膜组织中三个基因均未发现甲基化[12]。研究发现感染幽门螺旋杆菌的非肿瘤胃粘膜中p16， Ecad和DAPK基因的CPG岛高甲基化患胃癌的危险性显著增大[13]。pS2定位于第21号染色体，含有3个外显子和2个内显子，编码一含有信号肽的84个氨基酸的多肽，成熟后为一个60个氨基酸的分泌型胞外多肽。pS2主要分布在胃肠道的黏液分泌细胞，维持黏液分泌稳定。pS2在胃肠道黏膜受到急性损伤时表达增高，刺激胃肠道黏膜细胞的增生、修复、维护胃肠道黏膜的屏蔽作用。pS2曾被认为是胃癌特异的肿瘤抑癌基因，Fujimoto等检测了胃癌、腺瘤和非肿瘤性黏膜的pS2启动子的甲基化情况，结果显示：其主要发生在分化好的胃癌和肠化生黏膜中，发生pS2甲基化的胃癌不表达pS2蛋白。因此他们认为，pS2启动子甲基化参与早期胃癌的发生[14]。

1.3DNA甲基化与胃癌诊断某些基因DNA甲基化在胃癌细胞中表达水平异常，可能是胃癌发生发展分化程度的标志。研究发现p16基因在胃癌组织和血清中甲基化为44.2%和26.9%，且p16蛋白的表达减少和p16基因的甲基化正相关，提示血清中p16基因甲基化检测可能是早期发现诊断胃癌的重要分子标志物[15]。Oue N等通过对75例胃癌标本中12个肿瘤相关基因甲基化分析，发现高甲基化在Ⅲ/Ⅳ期胃癌出现的频率(26/40，65.0%)比Ⅰ/Ⅱ胃癌 (13/35，37.1%，P= 0.029)高，可以作为对胃癌临床分期诊断重要的标准[16]。钙粘蛋白家族的一个基因CDH4 (编码R- cadherin)，在95%的胃癌中发生甲基化，且在肿瘤新生物附近的正常组织也发生了甲基化， 可以说明CDH4甲基化是胃癌发生的一个早期事件。同时证实胃癌患者的外周血中可以检测到CDH4甲基化[17]，因此可以设想CDH4是胃癌的一个抑癌基因，可以作为胃癌早期诊断重要的标记分子。

1.4DNA甲基化与胃癌的治疗和预后学者已经在细胞水平上使甲基化的基因再活化，从而改善细胞的功能，然而发现对于人体治疗还难度很大。原因是使用DNA去甲基化的药物是非特异性的，如5-aza-cytidine或5-aza-2,deoxycytidine 抑制了DNA甲基转移酶而导致总体的低甲基化水平，不能对特定的基因产生作用。另外一个原因是大剂量的去甲基化药物不仅杀伤肿瘤细胞，对正常的细胞也有毒性作用。虽然这些药物有其弱点，但还是在临床上应用这些药物治疗骨髓增生异常综合征及急性髓性白血病上取得了成功。而在胃癌方面，有学者测定了胃癌患者肿瘤和外周血基因的异常甲基化，p16甲基化的出现率分别为66.7%和51.9%，而正常对照为阴性。结果表明血清中基因异常甲基化能如实的反映肿瘤中基因异常甲基化的情况，可作为胃癌患者的治疗筛选指标。另外，研究发现利用去甲基化药物处理胃癌细胞，使其R-RAS癌基因的第一个内含子的特异性CpG位点去甲基化从而使得R-RAS活化，参与了胃癌的发展。R-RAS表达沉默的胃癌细胞会导致其粘附性降低，这说明通过药物治疗抑制R-RAS信号通路是治疗胃癌很好的途径[18]。相信不远的将来，更有效的去甲基化药物的开发会给胃癌的治疗带来希望。

2 组蛋白与胃癌

在真核生物中，染色质由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成，其中组蛋白是真核细胞中特有的成分，富含带正电荷的精氨酸和赖氨酸，可以与带有负电荷的DNA分子紧密结合。组蛋白的N2末端可通过乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、糖基化、ADP核糖基化等进行翻译后的修饰，这些修饰信息称为组蛋白密码，其中以组蛋白乙酰化与肿瘤发生有着最为密切的联系。组蛋白的乙酰化被认为在转录子的调控中发挥着重要作用，而组蛋白去乙酰化导致抑癌基因转录阻滞从而在肿瘤中发挥着作用。p21(WAF1/CIP1) 是一种抑癌基因，研究发现胃癌标本中该基因的启动子区域组蛋白H3去乙酰化，且此去乙酰化与p21(WAF1/CIP1)蛋白低表达呈正相关。进而利用染色质共沉淀方法对29例胃癌标本检测，发现p21(WAF1/CIP1)启动子与编码区域中组蛋白H3去乙酰化均为10例(34.5%)。p21(WAF1/CIP1)启动子与编码区域中组蛋白H4去乙酰化分别为6例(20.7%)和16例(55.2%)。p21(WAF1/CIP1) mRNA 水平与p21(WAF1/CIP1)启动子区域组蛋白H3乙酰化状态呈正相关(P= 0.047)。在胃癌细胞系中加入组蛋白去乙酰化阻滞剂曲古抑菌素A，发现可以促进p21(WAF1/CIP1)蛋白的表达。并且发现p21(WAF1/CIP1) 启动子区域组蛋白H3的超乙酰化与其蛋白表达正相关，而跟组蛋白H4的超乙酰化无关；但p21(WAF1/CIP1)编码区的组蛋白H3和H4的超乙酰化都能促进蛋白的表达[19]。这说明组蛋白的乙酰化水平影响着抑癌基因p21(WAF1/CIP1)的表达从而参与胃癌的进展。有学者发现，SLC5A8基因的H3组蛋白的去乙酰化以及PINX1基因5’ UTR区域组蛋白H4去乙酰化影响SLC5A8和 PINX1的表达，从而在胃癌中发挥着作用。有学者将曲古抑菌素A作用于胃癌细胞系SGC-7901，发现可以抑制胃癌细胞生长和诱导凋亡，进而研究发现主要是通过调控如Bcl-2，Bax 和survivin等凋亡相关基因，并不是通过激活经典的半胱天冬酶凋亡信号途径[20]。为了进一步提高胃癌的化疗效果，研究人员将组蛋白去乙酰化抑制剂(TSA)，胃癌细胞系OCUM-8 和MKN-74以及抗癌药物如5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(PTX)、奥沙利铂 (OXA)、依立替康(SN38) 和吉西他滨(GEM) 共同培养，发现可以显著提高化疗效果。同时发现经TSA处理过的胃癌细胞系中p21、 p53、DAPK-1和DAPK-2高表达。这说明TSA和抗癌药物5-FU、 PTX及SN38联合应用治疗胃癌很有前景，其主要机制可能和TSA的协同效应引起的p21、p53、DAPK-1 和DAPK-2上调表达有关[21]。

表观遗传学与胃癌的发生发展如此密切，且表观基因改变是可逆的，能被治疗剂所逆转甚至可通过饮食预防，因此相信不久的将来会更广泛地应用到临床。

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[编辑] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.03.030

R730.23；R735.2

A

1673-1409(2010)03-R065-05